Mathis começou a atuar profissionalmente aos 16 anos de idade. Seu primeiro trabalho foi um comercial para “Always Slender Pads – Just For Teens”. Ela foi co-estrelada na série de televisão Aaron’s Way e Knightwatch de 1988 a 1989. Seu primeiro papel principal em um longa foi o de Nora em Pump Up the Volume (1990), em frente a Christian Slater, com quem ela namorou brevemente na época. Mathis pintou seu cabelo louro natural de preto para o papel, num esforço para mudar sua imagem de doce e inocente para forte.
Mathis apareceu nos filmes de televisão Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn, e To My Daughter em 1990. Mathis e Slater tiveram papéis de voz no filme de animação FernGully: A Última Floresta Tropical (1992). Ela apareceu em seguida na comédia This Is My Life (1992), escrita e dirigida por Nora Ephron, interpretando uma adolescente insegura. Mathis apareceu na peça Fortinbras, em Nova York, em outubro de 1992. Super Mario Bros. (1993), no qual ela interpretou a Princesa Daisy do popular videogame da Nintendo, foi uma bomba de bilheteria mas ganhou um culto desde o seu lançamento.
Mathis conheceu o ator River Phoenix no cenário de The Thing Called Love (1993) e os dois iniciaram um relacionamento. Ela estava com Phoenix em 31 de outubro de 1993, na noite em que ele morreu no Hospital Cedars-Sinai de uma overdose de drogas após um colapso fora do Viper Room de West Hollywood. Ela fez o filme Jack e Sarah (1995), que foi rodado em Londres, para sair do país após sua morte por causa da cobertura excessiva da imprensa.
Mathis apareceu na adaptação de 1994 de Little Women, e em How to Make an American Quilt (1995), ambos estrelados por Winona Ryder. Ela apareceu então em The American President (1995), interpretando a assistente do Presidente dos Estados Unidos. Mathis voltou a figurar com Christian Slater, junto com John Travolta, no filme John Woo’s Broken Arrow (1996). Ela tirou um pouco mais de um ano de licença de atuação depois que sua mãe morreu de câncer de mama em 1996.
Mathis mais tarde apareceu em American Psycho (2000), uma adaptação cinematográfica do romance homônimo de Bret Easton Ellis, de 1991. Ela estrelou em Atração (2000), e em A Linha Simiana (2001). Estrelou na minissérie de televisão TNT The Mists of Avalon (2001). Mathis estrelou com Thomas Jane em The Punisher (2004). Ela teve um papel convidado no programa televisivo ABC Lost as Olivia Goodspeed. Ela interpretou a filha de Jane Fonda no programa da Broadway “33 Variações”. Seu filme indie Lebanon, PA teve sua estréia mundial no Festival de Cinema SXSW 2010. Ela apareceu numa produção off-Broadway da peça, Love, Loss, and What I Wore, no Westside Theatre de Nova York em outubro de 2011.
Em 2013, Mathis interpretou a psiquiatra Alice Calvert na série de televisão da CBS Under the Dome, baseada em um romance de Stephen King. Em 2014, ela se juntou ao elenco da série drama de terror FX The Strain as Justine Feraldo, uma vereadora de Nova York para Staten Island.
Em 2019, Mathis apareceu Off-Broadway no papel de Kate Conlee em Make Believe, uma nova peça de Bess Wohl encenada no Second Stage Theater. Michael Greif dirigiu.
Her 2020 musical, Whisper House, foi adiado devido à pandemia de COVID-19.