Implicação clínica

Instabilidade por microssatélite (MSI) resulta do acúmulo sistemático de deleções/inserções em pequenas seqüências repetitivas de DNA em células tumorais com um deficiente sistema de reparo de descoordenação (MMR). A MSI ocorre em aproximadamente 15% de todos os cânceres colorretais e é clinicamente útil para identificar pacientes com câncer colorretal hereditário não-polipose (HNPCC, Síndrome de Lynch) causado por mutações na linha germinal dos genes MMR. O estado do MSI também pode prever a resposta/resistência ao câncer a certas quimioterapias.

Numa tentativa de padronizar a análise de MSI, um workshop do National Cancer Institute (NCI) de 1997 recomendou um painel de referência de cinco marcadores microsatélite para a detecção de MSI e estabeleceu diretrizes de classificação de MSI com base nos resultados. O painel de referência, referido como painel Bethesda, consiste em dois loci mononucleotídeos (Big Adenine Tract ou BAT-25 e BAT-26) e três loci dinucleotídeos (D2S123, D5S346 e D17S250). Usando o painel Bethesda, os cancros com instabilidade em 2 ou mais destes loci foram interpretados como MSI-high (MSI-H), e os cancros sem instabilidade em qualquer um dos cinco loci foram considerados Microsatellite Stable (MSS). Em um outro workshop de acompanhamento NCI, foi reconhecido que a sensibilidade e especificidade do painel Bethesda original poderia ser limitada devido à inclusão de repetições de dinucleotídeos, que são menos sensíveis e específicos que as repetições de mononucleotídeos para a identificação de cânceres com deficiências de MMR. Tem sido sugerido que um painel de repetições de mononucleotídeos quasimonômicos pode ser sensível e específico o suficiente para a detecção de cânceres com MSI elevado e pode evitar a necessidade de DNA compatível normal para os tumores a serem testados (1-8).

Sistema de Análise MSI (Kit de Uso Único de Pesquisa, Versão 1.2, Promega Corporation).

O Sistema de Análise MSI é um ensaio multiplex, baseado em PCR fluorescente para detecção de instabilidade de microssatélites. O Sistema de Análise MSI inclui iniciadores fluorescentes para co-amplificação de cinco marcadores de repetição de mononucleotídeos quasimonômicos (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27). Os produtos PCR são separados por eletroforese capilar (CE) usando um Analisador Genético Aplicado Biosystems 3500Dx. A instabilidade dos microssatélites em 2 ou mais loci mononucleotídeos é interpretada como MSI-alto; a instabilidade dos microssatélites em um único locus mononucleotídeo ou nenhuma instabilidade em qualquer dos loci testados é interpretada como estável por microssatélite (MSS). Tipicamente, amostras MSI-alto mostram instabilidade em todos os loci com uma diminuição média no tamanho do produto de 5 a 9 bases. A presença de MSI é detectada com uma especificidade analítica de pelo menos 99% e um limite de detecção de pelo menos 5%.

Uma característica importante do projeto do Sistema de análise MSI é o espaçamento entre os cinco loci diferentes, que geralmente excede o número típico de bases deslocadas (média de 5 a 9 bases) quando MSI está presente. O tamanho mais longo do amplicon PCR é de 154 pares de bases, o que é vantajoso para a análise de tecido fixado em formol e incluído em parafina (FFPE).

Este ensaio é o padrão para testes de MSI de rotina de alto rendimento, especialmente quando outros ensaios moleculares a jusante são solicitados na mesma amostra de DNA.

Requisitos de espécimes

Amostras aceitáveis para o ensaio são amostras de tecido carcinoma colorretal com fixação de formalina e inclusão de parafina com um tempo de fixação de 6-48 horas.

Volume

1 bloco de parafina representativo é preferível. Alternativamente, para amostras de ressecção é necessário um mínimo de 5 cortes de tecido não manchado (5 µm de espessura).

Instruções de armazenamento e envio

Manter e enviar amostras à temperatura ambiente.

Limitações

Insuficiente conteúdo tumoral pode não permitir a detecção de instabilidade do MSI: 10% das células tumorais são necessárias. O conteúdo tumoral é avaliado antes da análise e a macrodissecção é realizada. Fixadores além de formalina ou tempo de fixação prolongado podem dar resultados inadequados.

Requisitos especiais

Nenhum.

Tempo de retorno

Cinco a sete dias úteis para, respectivamente, lâminas e blocos de parafina.

2. Ensaio IdyllaTM MSI (CE-IVD) – Acreditação pendente

O ensaio IdyllaTM MSI (RUO) realiza a detecção da instabilidade do micro-satélite directamente a partir de cortes de tecido de cancro humano com parafina fixada em formalina (FFPE) utilizando uma reacção PCR seguida de uma análise da curva de fusão de alta resolução num instrumento IdyllaTM.

O ensaio realiza a detecção de mutações em 7 loci homopolímeros monomórficos para identificação de cancros humanos com instabilidade por microssatélite (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A, e SULF2). Estes biomarcadores são específicos do tumor, mostram uma alta frequência em cancros colorrectais e endometriais e são estáveis através de diferentes etnias. Além disso, estes biomarcadores tumorais específicos não requerem a análise de amostras de tecido normal pareadas.

O estado do MSI para uma amostra é determinado com a chamada final para todos os 7 biomarcadores. A instabilidade do microssatélite em 2 ou mais loci mononucleotídeos é interpretada como MSI-alto; a instabilidade do microssatélite em um único locus mononucleotídeo ou nenhuma instabilidade em qualquer um dos loci testados é interpretada como estável por microssatélite (MSS).

Este ensaio permite um teste MSI de baixa produção e é ideal para testes reflexos ou de resgate para obter ou confirmar rapidamente um resultado MSI preciso.

Requisitos de espécimes

Amostras aceitáveis para o ensaio são amostras de tecido de carcinoma colorretal fixadas em formol e incluídas em parafina com um tempo de fixação de 6-48 horas.

Volume

1 é preferível um bloco de parafina representativo. Alternativamente, para amostras de ressecção é necessário um mínimo de 2 cortes de tecido não manchado (5 µm de espessura; 50-600mm²).

Instruções de armazenamento e envio

Manter e enviar amostras à temperatura ambiente.

Limitações

Insuficiente conteúdo tumoral pode não permitir a detecção de instabilidade do MSI: 20% das células tumorais são necessárias. O conteúdo tumoral é avaliado antes da análise e a macrodissecção é realizada. Outros fixadores além de formalina ou tempo de fixação prolongado podem dar resultados inadequados.

Requisitos especiais

Nenhum.

Tempo de retorno

Três a cinco dias úteis para, respectivamente, lâminas e blocos de parafina.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Diretrizes revistas de Bethesda para o câncer colorretal hereditário não-polipose (Síndrome de Lynch) e Instabilidade Microsatélite. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Desenvolvimento de um ensaio de multiplex fluorescente para detecção de tumores MSI-High. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparação do Sistema de Análise da Instabilidade do Microssatélite e do Painel Bethesda para a Determinação da Instabilidade do Microssatélite em Cancros Colorectal. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Tissue-Embedded Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Repetidos mononucleótidos quasimonomórficos para análise da instabilidade de microsatélites de alto nível. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. Um painel de cinco marcadores em um PCR multiplex detecta com precisão a instabilidade do microssatélite – tumores colorretais de alto nível sem DNA de controle. Diagnóstico Mol Pathol 2012 Set;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detecção da instabilidade dos microssatélites por reacção em cadeia de polimerase mulitplexas fluorescentes. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detecção de instabilidade do microsatélite (MSI) em amostras de câncer colorretal com um novo conjunto de marcadores altamente sensíveis por meio do protótipo do teste IdyllaTM MSI Test. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Atualizado em 23 de maio de 2019