Wood Frog Freezing Survival
Winter Habitat
The wood frog (Rana sylvatica) habitam florestas que vão desde os Apalaches até às províncias marítimas e do oeste até ao norte do Alasca, até ao Círculo Árctico. O seu local de Inverno é uma toca rasa no chão da floresta, bem dentro da zona de geada, que é sobreposta por folhas e outros detritos orgânicos. Nossos estudos no sul do Ohio sugerem que as rãs da madeira são submetidas a vários episódios de congelamento que duram normalmente vários dias e expõem as rãs a temperaturas que caem tão baixas quanto -2° a -4°C; porém, em regiões mais ao norte, elas provavelmente sofrem temperaturas muito mais baixas e períodos mais longos de congelamento.
Iniciação do congelamento
Mecanismos transversais asseguram que as rãs da madeira congelem sem super-resfriar muito. Em primeiro lugar, devido à natureza altamente permeável da pele dos anfíbios, o gelo que envolve o sapo pode instantaneamente desencadear o congelamento dos fluidos corporais. Além disso, o refúgio de inverno da rã hospeda uma abundância de agentes nucleadores de gelo, tais como várias partículas minerais, ácidos orgânicos e certos micróbios, que podem causar o congelamento da rã. Experiências de laboratório sugerem que a ingestão destes agentes promove a formação de gelo em sapos tolerantes ao congelamento. De facto, várias estirpes de bactérias que expressam uma potente actividade nucleante do gelo foram cultivadas a partir dos intestinos das rãs da madeira colhidas no Inverno, indicando que tais bactérias são retidas durante a hibernação (Lee et al. 1995). A inoculação de gelo ou de agentes nucleantes do gelo no ambiente invernal é provavelmente o principal mecanismo que inicia o congelamento em anfíbios; não há necessidade de proteínas nucleantes do gelo ou de outros núcleos endógenos do gelo, como são encontrados em alguns invertebrados (Costanzo et al. 1999).
Freeze/Thaw Stresses
O congelamento prolongado solidifica os tecidos, detém a circulação vascular, e priva as células de oxigênio. Como o gelo se forma apenas em espaços extracelulares, a água dentro das células é osmoticamente puxada para fora, onde se junta à grade de gelo crescente. Durante este processo, as células podem encolher substancialmente, potencialmente com danos às membranas e aos sistemas de suporte estrutural. Macromoléculas e solutos tornam-se apinhados num volume de solvente decrescente, talvez com consequências adversas. A formação de gelo dentro dos fluidos corporais também representa a ameaça de lesões mecânicas pela crescente malha de gelo, particularmente em tecidos e órgãos compactos e altamente estruturados. Frentes de gelo podem cisalhar e separar tecidos, perturbando os sistemas de comunicação intercelular. Ao descongelar, grandes poças de fluidos diluídos formam-se em espaços extracelulares. Volume celular, equilíbrio hidroosmótico e estado energético devem ser restaurados.
Capacidade de tolerância ao congelamento
Estudos laboratoriais mostraram que as rãs de madeira podem sobreviver: (a) o congelamento de até 65-70% da sua água corporal; (b) uma temperatura corporal mínima de -6°C; e (c) o congelamento ininterrupto para ≥ 4 wk. A tolerância ao congelamento varia sazonalmente, uma vez que as rãs são mais resistentes durante o Inverno. Essa variação sazonal na capacidade de tolerância ao congelamento pode refletir parcialmente as mudanças na quantidade de crioprotetor que pode ser produzido. A sobrevivência depende do congelamento lento para que os mecanismos crioprotetores possam ser mais completamente expressos.
Freezing Recovery
Recovery is notably rapid, with basic physiological and behaviouroral functions usually return within several hours of thawing (link to video low bandwidth/ high bandwidth; link to NOVA scienceNOW story). (Slippery Rock University), nosso trabalho tem mostrado que a dinâmica de recuperação é caracterizada pela restauração seqüencial de funções fundamentais para funções progressivamente mais complexas. Por exemplo, o coração retoma a bater mesmo antes que o gelo no corpo tenha derretido completamente, e a respiração pulmonar e a circulação sanguínea são restauradas logo em seguida. A contratilidade nos músculos das extremidades da anca retorna 1-2 h após o descongelamento, enquanto a função do nervo ciático inervante é restaurada em aproximadamente 5 h. A retração das extremidades da anca e os reflexos da direita retornam várias horas depois e as rãs geralmente exibem posturas corporais normais e funções motoras coordenadas entre 14-24 h. Comportamentos de ordem mais elevada, como o acasalamento e o comportamento de corte, não são restaurados até pelo menos vários dias depois (Costanzo et al. 1997).
Adaptações da tolerância ao congelamento
Uma resposta promovendo a tolerância ao congelamento em rãs tolerantes ao congelamento é a redistribuição de até 60% da água normalmente encontrada nos tecidos. Dissecar uma rã de madeira congelada revela que grande parte do gelo é sequestrado dentro do sistema linfático e no celoma, onde pode se formar sem danificar tecidos e órgãos delicados (Lee et al. 1992).
A tolerância ao congelamento também é promovida pela rápida síntese de glicose do glicogênio hepático e a distribuição deste agente crioprotetor às células em todo o corpo. A glicose acumulada aparentemente aumenta a sobrevivência das células, tecidos e órgãos porque a administração experimental de glicose adicional ao sapo aumenta sua tolerância ao congelamento (Costanzo et al. 1993). Uma das principais funções da glicose é aumentar a pressão osmótica dos fluidos corporais, que por sua vez reduz a quantidade de gelo que se forma a qualquer temperatura. A glicose transportada para as células age como um osmólito, diminuindo o grau de contração celular durante o congelamento, e também serve como um combustível fermentável que pode ser metabolizado na ausência de oxigênio. O sapo da madeira também usa uréia como crioprotetor. Ao contrário da glicose, a ureia é acumulada durante o Outono e o início do Inverno, e já está localizada dentro das células quando o congelamento começa. Algumas evidências sugerem que a uréia é mais eficaz do que a glicose na prevenção da crioinjúrio (Costanzo e Lee 2005).
Aquaporinas (AQPs) e transportadores de uréia facilitadores (UTs) são duas proteínas transportadoras que têm sido implicadas em uma ampla gama de papéis fisiológicos em vários organismos. Recentemente, estas proteínas têm sido encontradas em uma variedade de anuros; entretanto, seu significado fisiológico ainda não é totalmente compreendido. A fim de elucidar a importância dos AQPs e UTs no equilíbrio osmolítico em rãs hibernantes, estamos examinando a expressão destas proteínas em rãs com diferentes graus de terrestreismo. Além disso, estamos medindo variações sazonais na expressão, bem como mudanças nos níveis de expressão em resposta às tensões relacionadas ao inverno, no sapo da madeira.