Abstract

Foram avaliados os efeitos do zinco, magnésio e cálcio no plasma seminal no tempo de gravidez (TTP) em casais saudáveis, nos parâmetros de sêmen convencional e nos parâmetros de análise de sêmen assistida por computador (CASA). A localização dos íons de zinco quelatáveis no plasma seminal e nos espermatozóides foi avaliada por autometalografia (AMG). Foram avaliadas as diferenças na localização do zinco quelatável em amostras com alto e baixo zinco total. As amostras de sêmen de 25 casais com TTP curto e 25 casais com TTP longo foram submetidas à análise convencional de sêmen, CASA, zinco e magnésio por espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente, e cálcio por espectrometria de absorção atômica por chama. Os cátions foram fortemente relacionados entre si, mas não foi encontrada correlação com os parâmetros de TTP ou sêmen convencional. Amostras de sêmen com altas concentrações de zinco exibiram uma menor motilidade estatisticamente significativa, avaliada pelos parâmetros CASA, velocidade e linearidade da linha reta do que amostras com baixo conteúdo de zinco. A concentração de cálcio também mostrou diferenças estatisticamente significativas para os mesmos parâmetros, mas o efeito foi removido pela introdução da concentração de zinco em um modelo de regressão múltipla. Amostras de sêmen com alto teor de zinco total exibiram uma coloração mais forte do plasma seminal na AMG. Sugere-se que concentrações elevadas de zinco seminal têm um efeito supressor na mobilidade progressiva dos espermatozóides (qualidade de movimento), mas não na percentagem de espermatozóides móveis (quantidade de movimento).

Introdução

O teor total de zinco no sémen de mamíferos é elevado, e o zinco tem sido considerado crítico para a espermatogénese. A deficiência de zinco está associada com hipogonadismo e desenvolvimento insuficiente das características sexuais secundárias em humanos (Prasad, 1991), e pode causar atrofia dos túbulos seminíferos no rato e, portanto, falha na espermatogênese (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Altas concentrações de zinco têm sido relatadas para diminuir o consumo de oxigênio na célula espermática (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990), e a reação acrossômica induzida por albumina (Foresta et al., 1990). A fixação/descolagem da cabeça e condensação/descondensação da cromatina nuclear também é influenciada pelo zinco seminal (Kvist, 1980; Bjorndahl e Kvist, 1982). Houve relatos contraditórios sobre o efeito do zinco seminal na motilidade do esperma (Stankovic e Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Foi demonstrado que a quelação dos íons de zinco afeta a motilidade do esperma (Saito et al., 1967; Danscher e Rebbe, 1974), e foi sugerido que a biodisponibilidade do zinco ligado a proteínas vesiculares de alto peso molecular, ao invés do zinco seminal total, deveria ser uma medida do efeito do zinco na função espermática (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Este estudo foca principalmente no zinco. Foi avaliada a associação do zinco seminal e, em certo grau, do magnésio e do cálcio, com o time-to-pregnancy (TTP) em casais saudáveis. Além disso, foi avaliada a correlação entre esses cátions divalentes com os parâmetros de sêmen convencional e os parâmetros de análise de sêmen assistida por computador (CASA).

Autometallografia (AMGZn) é um método histoquímico para a detecção de íons de zinco e íons de zinco soltos (zinco quelatável) no tecido. Foram investigadas diferenças na localização dos íons de zinco a níveis microscópicos de luz e microscópicos eletrônicos nos espermatozóides e plasma seminal de homens com alto zinco total e baixo zinco total.

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Materiais e métodos

População estudantil

Um total de 430 casais foram recrutados entre 52 255 membros de quatro sindicatos. Foram obtidas amostras de sémen dos 430 casais, a motilidade foi avaliada manualmente e pela CASA (ver mais adiante), e as amostras foram armazenadas congeladas (-20°C) até nova análise. Casais sem experiência reprodutiva anterior foram registrados quando interromperam a contracepção e foram seguidos por um mínimo de seis ciclos menstruais completos ou até que a gravidez fosse reconhecida. Dos 430 casais, 50 casais que engravidaram foram selecionados para o presente estudo: os 25 casais com o TTP mais curto (S-TTP, mediana de 1 mês, variação de 1-2 meses), e os 25 casais com o TTP mais longo (L-TTP, mediana de 10 meses, variação de 7-28 meses). As amostras de sémen destes 50 casais foram submetidas às análises abaixo mencionadas.

Características convencionais do sémen

As amostras de sémen foram obtidas por masturbação em frascos de poliestireno estéril de 50 ml após 3 dias de abstinência recomendados. Após a liquefação as amostras foram analisadas à temperatura ambiente de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (1992).

Volume foi medido em um tubo de vidro Falcon graduado de 10 ml (precisão de 0,1 ml). Foram realizadas avaliações manuais da motilidade do esperma em uma câmara de contagem Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Cada espermatozóide encontrado foi classificado da seguinte forma: a: motilidade progressiva rápida, b: motilidade progressiva lenta ou lenta, c: motilidade não progressiva, d: immotilidade. Foram realizadas pelo menos 2×100 pontuações. Se a diferença entre duas contagens consecutivas excedesse 10%, seriam realizadas duas novas contagens. A percentagem de espermatozóides móveis foi definida como grupos `a + b + c’. A concentração foi medida em uma câmara de contagem de Makler, e a morfologia foi classificada de acordo com o critério de Tygerberg descrito por Kruger et al. (1986) sobre esfregaços secos ao ar fixados em etanol e éter, corados utilizando a técnica de Papanicolaou (Organização Mundial de Saúde, 1992). A pontuação da morfologia foi realizada por um único técnico de laboratório treinado. A viabilidade espermática foi determinada em esfregaços corados com eosin-negrosina.

Análise de sêmen assistida por computador

Material para CASA foi obtido da seguinte forma: 4,5 μl de espermatozóides frescos, bem misturados, foi transferido com uma pipeta para uma câmara de contagem de Makler com uma profundidade de 10 μm. A amostra foi colocada num microscópio de contraste de fase Olympus BH-2 (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca) com uma placa de aquecimento (37°C) a uma ampliação de ×200. Uma câmara de vídeo Sony DXC-107 (Sony Corp., Tóquio, Japão) transferiu as imagens para um monitor de vídeo a cores Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tóquio, Japão). As gravações das imagens foram feitas num gravador de vídeo cassete JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tóquio, Japão). As gravações foram posteriormente analisadas num Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Reino Unido) a uma frequência de aquisição de 25 Hz, tempo de rastreamento 2 s (total de 50 frames), campo de visão 300×300 μm (permitindo a detecção de todos os valores de velocidade de linha reta de até 150 μm/s). Foram analisados 100 espermatozóides por amostra.

Os seguintes parâmetros foram derivados das análises: velocidade curvilínea (VCL), velocidade em linha reta (VSL), linearidade (LIN), velocidade média do trajeto (VAP) e amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH).

Determinação de zinco, magnésio e cálcio no sêmen

Zinco seminal, magnésio e cálcio foram medidos em todas as 50 amostras. As concentrações de zinco e magnésio no sêmen foram determinadas por espectrometria de massa plasmática acoplada indutivamente (ICP-MS). O instrumento foi um PQ2+ da Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). Uma alíquota de 20 μl foi diluída 100 vezes com uma solução contendo 5 g/l de 25% de amônia (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Bélgica) e 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, EUA) em água de 18 MW Millipore. Como padrão interno, o scandium (AccuStandard, New Haven, CT, EUA) foi adicionado a uma concentração final de 100 μg/l. Todas as amostras foram preparadas em duplicado. A calibração foi realizada utilizando amostras em branco, às quais foram adicionados zinco e magnésio (AccuStandard) a concentrações finais de 1, 2 e 3 mg/l, correspondentes a concentrações de 100, 200 e 300 mg/l nas amostras originais de sémen. Esta análise foi realizada em modo salto de pico com medidas a 24Mg, 66Zn e 45Sc.

Determinação de cálcio foi feita nas mesmas preparações utilizando espectrometria de absorção atômica por chama (FAAS). O instrumento foi um Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, EUA). A calibração foi realizada para concentrações correspondentes a 100, 200 e 400 mg/l nas amostras originais de sêmen. As amostras com altas concentrações de cálcio foram diluídas três vezes mais para se enquadrarem na curva de calibração.

Os limites de detecção, calculados como três vezes o desvio padrão para 10 amostras em branco preparadas na mesma ocasião que as amostras, foram de 1 mg/l para o zinco, 3 mg/l para o magnésio e 2 mg/l para o cálcio (expressos como concentrações nas amostras de sémen não diluído). Os coeficientes gerais de variação nas determinações, calculados a partir dos resultados das análises em duplicado, foram de 18% para o zinco, 32% para o magnésio e 17% para o cálcio.

Também foram feitas preparações para determinação do zinco por espectrometria de absorção atómica por chama (FAAS) em dez das amostras. A análise de regressão linear dos resultados ICP-MS versus FAAS deu uma inclinação de 0,79 (intervalo de confiança de 95%: 0,58-1,00), uma intercepção de 13 μg/l e r2 de 0,90. Os resultados um pouco maiores para as análises ICP-MS não foram, portanto, estatisticamente significativos.

Desenvolvimento amostralográfico (AMG) de esfregaços de sêmen para análise microscópica de luz

Cinco amostras com alto (242-308 mg/l) e 5 com baixo (38-57 mg/l) teor de zinco conforme determinado pelo ICP-MS foram incubadas em 0,5% de sulfeto de sódio (Bie & Berntsen) por 30 min para criar as grades de sulfeto de zinco. Os esfregaços da solução de ejaculado/sulfeto foram feitos em lâminas de vidro lavadas de Farmer. Os esfregaços foram secos ao ar, fixados em glutaraldeído a 3% (Bie & Berntsen) por 30 min, e colocados em tampão fosfato 0,1 M por 3×2 min e uma vez em água destilada por 2 min.

Os esfregaços foram então desenvolvidos em AMG para amplificar as treliças de sulfeto de zinco. O revelador consistiu em 60 ml de solução de goma arábica filtrada (1 kg dissolvido em 2 l de água destilada; Bidinger A/S, Aarhus, Dinamarca), 10 ml de tampão citrato de sódio e 0,85 g de hidroquinona (Merck, Darmstadt, Alemanha) dissolvido em 15 ml de água quente destilada. Imediatamente antes do uso, 0,11 g de lactato de prata (Fluka, Buchs, Suíça) em 15 ml de água destilada foi adicionado e a solução foi cuidadosamente misturada.

Boiões de sémen enxaguados contendo os esfregaços de sémen foram colocados num banho de água a 26°C e transferidos para uma caixa à prova de luz. O revelador AMG recentemente preparado foi despejado nos frascos, e os esfregaços foram desenvolvidos por 30 minutos na caixa escura.

Após o desenvolvimento, os esfregaços foram enxaguados em água corrente de-ionizada por 10 minutos, colocados em tiossulfato de sódio a 5% por 5 minutos, lavados com água corrente de-ionizada por 2 minutos, pós-fixados com etanol a 70% por 30 minutos, e finalmente lavados com água corrente de-ionizada por 2 minutos. A contracoloração foi realizada com uma solução aquosa a 0,1% de azul toluidina, pH 4,0 (1 g de azul toluidina em 1000 ml de tampão): 614,5 ml de ácido cítrico mono-hidratado 0,1 M e 385,5 ml de fosfato de hidrogênio dihidratado 0,2 M; Merck, Darmstadt, Alemanha). Os esfregaços foram colocados durante 2 × 2 min em água destilada, 3 × 3 min em etanol a 99%, 3×3 min em xilol, e finalmente montados com DEPEX (Merck, Darmstadt, Alemanha).

Preparações de esfregaços de sêmen para análise microscópica eletrônica

Escregaços de amostras de sêmen foram preparados como descrito acima, exceto que não foram montados com DEPEX. Após o procedimento foi adicionado 0,5% de tetróxido de ósmio durante 30 min, e os esfregaços foram colocados durante 3×2 min em tampão e 1×2 min em água destilada. Os esfregaços controlados por ósmio foram estudados no microscópio de luz, e as áreas de interesse para análises microscópicas eletrônicas posteriores foram marcadas com uma faca de diamante.

Os esfregaços selecionados foram desidratados em soluções graduadas de etanol e embebidos em Epon (Bie & Berntsen). Os blocos Epon colocados em cima das áreas de interesse previamente marcadas foram mantidos a 60°C durante 24 h e depois quebrados dos esfregaços de vidro. As seções semi-finas (3 μm) foram cortadas e colocadas em lâminas de vidro. Após análises microscópicas leves, cortes selecionados foram re-inseridos em Epon, e cortes ultrafinos foram feitos e retificados com citrato de chumbo antes do exame em microscópio eletrônico JEOL 100S.

Métodos estatísticos

Análises de regressão múltipla foram aplicadas aos dados para detectar o impacto dos parâmetros individuais no resultado. Os coeficientes de correlação de classificação de Spearman foram calculados para várias correlações. Para comparação dos grupos foi realizado o teste de Wilcoxon rank-sum para diferença nas medianas.

Resultados

Na Tabela I os teores de zinco, magnésio e cálcio são apresentados juntamente com a proporção relativa dos cátions no plasma seminal. A comparação das medianas destes parâmetros nos dois grupos S-TTP versus L-TTP por testes t de duas amostras não revelou diferenças estatisticamente significativas para nenhum destes parâmetros. Foi encontrada uma forte correlação positiva entre zinco, magnésio e cálcio (os coeficientes de correlação de Spearman foram 0,79-0,86, P < 0,01) (Figura 1).

Nem qualquer um dos catiões estava estreitamente correlacionado com qualquer um dos parâmetros do sêmen convencional. Ao executar a análise de regressão múltipla em todos os dados, somente o conteúdo de zinco saiu com um valor de P abaixo de 0,05 para os seguintes parâmetros CASA: VSL 0,04, e LIN 0,008. A entrada de magnésio ou cálcio no modelo não melhorou os valores.

As amostras de sêmen foram divididas em dois grupos de igual tamanho de acordo com o status de catiões de cada catião. Foram identificados os seguintes pontos de divisão (medianas para todas as 50 amostras): zinco 112 mg/l, magnésio 98 mg/l e cálcio 476 mg/l. Foram detectadas algumas diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos (Tabela II). Os valores de P para os grupos de zinco indicaram as maiores diferenças, os grupos de cálcio com diferenças intermediárias, e os grupos de magnésio apresentando apenas diferença pobre (exceto LIN).

Para a proporção relativa entre os cátions (Tabela III) os pontos de divisão foram: zinco:magnésio 1,26, e zinco: cálcio 0,22. As amostras com razão zinco:cálcio acima de 0,22 apresentaram valores estatisticamente significativos inferiores para os parâmetros CASA VSL, LIN e STR em comparação com aquelas amostras com razão abaixo de 0,22. A correlação zinco:magnésio é de 0,86 (coeficiente de correlação de Spearman), e para zinco:cálcio é de 0,79. O conteúdo de zinco parece estar mais estreitamente associado ao magnésio do que ao cálcio, o que poderia explicar a diferença entre os grupos.

Ao avaliar o conteúdo de iões de zinco nas preparações de AMG, foi detectada uma diferença ao nível microscópico de luz em amostras com baixo total de zinco em comparação com amostras com alto total de zinco. A Figura 2 mostra diferenças na coloração de AMG numa amostra com 299 mg/l e numa amostra com 53 mg/l de zinco seminal. A coloração ao redor do acrossoma, da cauda e no plasma seminal foi encontrada esparsa nas amostras com baixo total de zinco. Não foi possível confirmar estes achados a nível microscópico electrónico (Figura 3A), e em particular não foi observada diferença na coloração intracelular dos espermatozóides. As figuras 3B e 4 mostram a localização do íon de zinco na cauda dos espermatozóides. É encontrada em toda a cauda concentrada nas fibras acessórias flagelares e na membrana. No micrômetro do plasma seminal foram encontrados corpos ricos em conteúdo de íons de zinco (Figura 5).

Discussão

Este é, até onde sabemos, o primeiro estudo para avaliar o impacto do zinco seminal, magnésio e cálcio nos parâmetros TTP e CASA em seres humanos saudáveis. Foi encontrada uma associação entre altas concentrações de zinco e baixa linearidade dos movimentos dos espermatozóides, expressa por uma diminuição da PAV, da LIN, da VSL e do STR. As concentrações de magnésio e cálcio estavam estreitamente correlacionadas com a concentração de zinco, mas não estavam tão fortemente associadas com os parâmetros CASA. A concentração motil não foi afetada pela concentração total de zinco, magnésio e cálcio. Entretanto, foram encontradas diferenças entre o alto versus baixo conteúdo de zinco e alguns parâmetros CASA (Tabela II). Ao comparar as 25 amostras de sémen com o menor teor total de zinco (mediana 72 mg/l) com as 25 amostras com o maior teor total de zinco seminal (mediana 187 mg/l), o teste de Wilcoxon revelou uma diferença estatisticamente significativa nas medianas para VSL (P = 0,004) bem como LIN (P = 0,001). Para a PAV a diferença também foi significativa (P = 0.02). Nenhuma diferença foi encontrada para VCL. Como não houve diferenças na percentagem motil ou concentração motil nas amostras de zinco baixo e alto, parece, portanto, que um ambiente rico em zinco faz com que as células espermáticas se movimentem de forma mais aleatória e menos avançada. Não parece reduzir o número de espermatozóides móveis.

VSL expressa o quanto a espermatozóide se move em linha recta num determinado período de tempo, e é mais provável, de um ponto de vista clínico, que seja o parâmetro CASA mais importante. Um estudo de Moore e Akhondi (1996) sobre a capacidade de fertilização dos espermatozóides epidídimos de rato mostrou um declínio na VSL para ser altamente correlacionado negativamente com o resultado da fertilização in vitro.

Overdade dos anos tem havido muito debate sobre o papel do zinco plasmático seminal nas funções espermáticas. A cabeça do esperma acumula uma concentração muito maior do que o plasma seminal, e o zinco é essencial para a estabilidade da cromatina e para a capacidade da cromatina descondensar no momento apropriado (Kvist, 1982; Kvist e Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), e um papel fisiológico do zinco como conservador de um mecanismo inerente para o descolamento da cabeça da cauda tem sido sugerido (Bjorndahl e Kvist, 1982). No entanto, tem havido relatórios contraditórios sobre o efeito do zinco seminal na motilidade do esperma, e a maioria dos estudos tem lidado com avaliações quantitativas. Em um estudo de Lewis-Jones et al. (1996) 1178 pacientes encaminhados para tratamento de fertilidade tinham concentrações de zinco e frutose no plasma seminal medidas, mas para o zinco não foi encontrada correlação estatisticamente significativa com a motilidade. Abou-Shakra et al. (1989) mediram vários oligoelementos no plasma seminal usando ICP-MS, mas não detectaram nenhuma correlação da concentração de zinco seminal com a densidade espermática ou motilidade em homens normospérmicos, oligospérmicos ou azoospérmicos. As concentrações de zinco em seu estudo foram semelhantes aos níveis apresentados neste estudo. Danscher et al. (1978) relataram altas concentrações de zinco a serem associadas à motilidade do esperma deprimido, enquanto outros relataram alto conteúdo de zinco no plasma seminal a ser associado a um alto grau de motilidade do espermatozóide (Stankovic e Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

Neste estudo nós tratamos tanto de avaliações quantitativas do zinco total quanto da determinação qualitativa da localização do íon de zinco no espermatozóide e no fluido seminal. Embora não tenham sido detectadas diferenças no conteúdo de iões de zinco dos espermatozóides a nível ultra-estrutural (Figura 2A) entre as amostras com zinco total alto ou baixo, as características observadas a nível microscópico claro (Figura 1) podem reflectir uma relação entre a quantidade total de zinco e os iões de zinco livres no plasma seminal. Em estudos recentes Lewis-Jones et al. (1996) e Carpino et al. (1998) concluíram que o zinco total seminal é um marcador não confiável da atividade espermatogênica, e sugerem que os íons de zinco biodisponíveis ligados a proteínas vesiculares de alto peso molecular sejam um melhor índice. O método AMG aqui apresentado demonstra o zinco quelatável, ou seja, íons de zinco no plasma ou zinco frouxamente ligado a macromoléculas. O zinco ligado firmemente a proteínas não será detectado pela AMG e não pode ser quelatado. Concordamos com os estudos mencionados que é o zinco biodisponível (portanto quelatável) que exerce funções sobre as células espermáticas, incluindo a motilidade. Este estudo indica que as concentrações totais de zinco e zinco quelatável estão relacionadas. Outros estudos são necessários, e a análise de imagens computadorizadas, por exemplo, de preparações de AMG pode ser uma ferramenta importante.

Em contraste com os efeitos do zinco, a alta concentração de magnésio em si não parece ter qualquer efeito inibidor na motilidade do esperma. Foi encontrado um efeito negativo no LIN, mas não foi suficientemente grande para ter qualquer impacto sobre os outros parâmetros CASA. Foi relatado que o plasma seminal humano contém grânulos secretores e vesículas de origem prostática que podem ter um efeito regulador na motilidade do esperma ao modular a concentração de cátions essenciais em seu ambiente (Stegmayr et al., 1982). As membranas destas organelas contêm ATPase dependente de Mg2+ e Ca2+, inibida competitivamente por Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Alta correlação positiva entre zinco e magnésio no plasma seminal foi previamente relatada (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), e neste estudo foram encontradas fortes intercorrelações similares entre os três cátions (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Cálcio é importante para a fisiologia do esperma, incluindo a motilidade (Morton et al, 1974; Lindemann et al., 1987), metabolismo (Peterson e Freund, 1976), reação acrossômica, e fertilização (Yanagimachi e Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). O papel do cálcio seminal na motilidade do esperma não é, no entanto, totalmente compreendido. Thomas e Meizel (1988) encontraram quelação de íons de cálcio extracelulares com EGTA para inibir a reação acrossômica, mas ao mesmo tempo não ter efeito sobre a motilidade. A adição da reação acrossômica induzindo a ionomicina de catião ionóforo divalente também não teve efeito sobre a motilidade, mas aumentou significativamente o número de espermatozóides com reação acrossômica. Magnus et al. (1990) não encontraram associação entre as concentrações de cálcio ionizado e a proporção de espermatozóides com movimento progressivo. Arver e Sjöberg (1982) relataram baixo cálcio ionizado para ser associado com mais e melhores espermatozóides móveis progressivos. Prien et al. (1990) compararam a motilidade, velocidade e movimento progressivo dos espermatozóides com o cálcio total e ionizado em pacientes com mobilidade normal (>60%) e diminuição (<60%) da motilidade dos espermatozóides. Não foi encontrada diferença no cálcio total, mas uma diminuição estatisticamente significativa no cálcio ionizado seminal foi encontrada naqueles homens com diminuição da motilidade. Neste estudo foi medido o cálcio total, mas a capacidade de ligação ao cálcio do plasma seminal não é conhecida. Quanto ao cálcio, não foi detectado impacto na concentração motil, e as correlações com os parâmetros CASA foram mais fracas do que as do zinco (Tabela II). Tanto VSL como LIN mostraram correlações inversas significativas com a concentração total de cálcio (P = 0,02 para ambos), enquanto que VCL não foi afetada. Mas a adição da concentração de zinco em uma análise de regressão múltipla removeu os efeitos da concentração total de cálcio sobre a motilidade. Isto está de acordo com o estudo anteriormente mencionado por Prien et al. (1990). Neste estudo, amostras com baixa relação zinco/cálcio apresentaram valores estatisticamente significativos de CASA (VSL, LIN e STR) melhores em comparação com aquelas com alta relação. Isto se deve principalmente a diferenças na concentração de zinco.

A precisão das determinações de zinco, magnésio e cálcio neste estudo foi relativamente pobre, com coeficientes de variação de 18, 32 e 17%, respectivamente. A razão é provavelmente a não homogeneidade das amostras, o que em combinação com os pequenos volumes de amostra (20 μl) pode ter prejudicado a precisão. Apesar da grande imprecisão, a variação gerada nas determinações de zinco e magnésio foi menor quando comparada à grande faixa de concentração nas amostras.

Foi previamente demonstrado que a quelação dos íons de zinco afeta a motilidade espermática no homem (Danscher e Rebbe, 1974), no rato e no cão (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Estudos com quelação intra e extracelular de íons de zinco estão sendo realizados atualmente, e isto pode revelar a importância da localização dos íons de zinco no líquido seminal e no espermatozóide.

Os autores agradecem a H. Brandstrup, D. Jensen, K. Lunding, K. Wiedemann, Anna Akantis e A. Meier pela hábil assistência técnica. O Danish Fecundity Study Group apoiou este estudo que faz parte de um estudo de acompanhamento colaborativo sobre os determinantes ambientais e biológicos da fertilidade. O projecto é coordenado pelo Instituto Steno de Saúde Pública, Universidade de Aarhus, e é realizado em colaboração com o Departamento de Crescimento e Reprodução do Hospital Universitário Nacional de Copenhaga. O estudo foi apoiado principalmente por uma bolsa da Fundação de Pesquisa da Universidade de Aarhus (J 1994-7430-1). Apoio adicional foi também dado pelo Danish Medical Research Council (J 12-2042-1), a Danish Health Insurance Foundation (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) e The Ciconia Foundation.

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