Buferele de acetat de amoniu pot cauza diverse probleme în laborator. Două probleme comune includ creșteri surprinzătoare ale contrapresiunilor HPLC-MS la pornirea instrumentului după o noapte de depozitare și dificultăți cu sensibilitatea MS.
Creșterea contrapresiunii instrumentului la utilizarea acetatului de amoniu (și a formiatului de amoniu) este o problemă frecventă întâlnită pe forumurile de cromatografie, în special atunci când instrumentul a stat în picioare peste noapte sau la primele câteva rulări din fiecare zi. Tampoanele apoase cu grad ridicat de solubilitate pot provoca o mulțime de bătăi de cap. Aceștia devin problematici în utilizarea practică, blocând capilarele, precolumnele și frite de capăt de coloană analitică.
Aceste probleme rezultă invariabil din înțelegerea greșită a solubilității tamponilor în medii apoase organice mixte. Acest lucru poate fi depășit cu ajutorul datelor prezentate în figura 1.
Figura 1: Solubilitatea a cinci tampoane în amestecuri cu acetonitril. (Adaptat cu permisiunea din Ref. 1)
Figura 1 arată clar că solubilitatea acetatului de amoniu în amestecuri binare care conțin peste 90% acetonitril este din ce în ce mai limitată ca solubilitate și este complet insolubilă în 100% acetonitril. În timp ce 20mM de acetat de amoniu reprezintă limita de solubilitate la 90% acetonitril, această limită scade brusc la 10mM de acetat de amoniu (o concentrație tampon populară utilizată în aplicațiile LC-MS) la amestecuri cu 95% acetonitril. Depășirea acestor limite de solubilitate are ca rezultat un lichid tulbure din cauza precipitatului fin de acetat de amoniu din cadrul soluției. Acesta poate bloca capilarele și fritele coloanei, provocând o creștere a contrapresiunii sistemului. De asemenea, trebuie remarcat faptul că datele din figura 1 sunt obținute folosind un tampon de înaltă calitate – solubilitatea va scădea dacă se folosesc reactivi de calitate (puritate) mai slabă a sării tampon. Evitați să încercați să dizolvați acetatul de amoniu în acetonitril pur, chiar dacă soluția poate avea apoi adaos de apă. Deși inițial poate părea că tamponul este solubil, acesta va cădea rapid din soluție (figura 2).
Figura 2: Reziduul de acetat de amoniu creat la “dizolvarea” acetatului de amoniu în acetonitril, urmat de adăugarea de apă pentru a obține raportul organic/acvatic necesar al eluentului (Fotografie obținută prin amabilitatea dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Marea Britanie).
Într-un gradient tipic de HPLC cu fază inversă, acest lucru nu este poate o problemă atât de mare, cu excepția cazului în care, desigur, gradientul dumneavoastră ajunge la >90% acetonitril. Cu toate acestea, există și alte considerente, cum ar fi procentajele relative de solvent organic pe care le poate întâlni tamponul apos atunci când se amestecă folosind sisteme de amestecare de joasă sau înaltă presiune, atunci când se injectează probe dizolvate în procentaje mari de acetonitril sau, în cel mai rău dintre toate cazurile, atunci când sistemele sunt spălate cu 100% acetonitril pentru a elimina contaminanții din coloană sau pentru stocarea peste noapte.
Există un alt considerent, atunci când se utilizează acetonitril 100% pentru stocarea coloanei, și anume că pot apărea schimbări mari de pH în solventul 100% organic și trebuie să se țină seama dacă aceste schimbări de pH pot duce pH-ul de stocare a coloanei într-un interval în care poate fi posibilă dizolvarea matricei de silice, ceea ce duce la formarea de “finețe” în coloană, care va duce în cele din urmă la blocarea coloanei (la un pH ridicat) sau la îndepărtarea liganzilor din faza legată (la un pH scăzut).
Acetatul de amoniu ca tampon
Mulți au ales să folosească acetatul de amoniu ca tampon, în special atunci când se utilizează detecția MS, datorită volatilității sale inerente și a înclinației scăzute pentru contaminarea sursei API. Cu toate acestea, trebuie să fim atenți la această solubilitate limitată și să ne adaptăm practicile HPLC în consecință. Înțelegeți dacă utilizarea acetatului de amoniu este adecvată pentru experiment și dacă este de fapt necesar un tampon. Cerințele de utilizare și alegerea și concentrația corespunzătoare a unui tampon sunt frecvent neînțelese. Acetatul de amoniu este cazul de față pentru a investiga utilizările și utilizările greșite ale acestui sistem tampon foarte iubit.
Bufferii sunt necesari pentru a rezista la mici modificări ale pH-ului (în primul rând ale eluentului) și pentru a se asigura că coloana HPLC rămâne într-o stare de sarcină constantă (în primul rând starea de ionizare a speciilor reziduale de silanol de pe suprafața suportului de silice). Modificările de pH pot cauza probleme în ceea ce privește stabilitatea timpului de retenție, forma vârfului și (atunci când se utilizează Electrospray MS) sensibilitatea instrumentului. În mod obișnuit, cea mai mare “provocare” pentru pH-ul sistemului va proveni din amestecarea diluantului de probă cu eluentul în componentele de legătură dintre injector și coloana HPLC (sau precolumna) și la capul coloanei. În cazul în care diluantul de probă are un pH diferit, atunci analitul (sau o parte din moleculele de analit) își poate schimba starea de ionizare și, ca urmare, poate fi cromatografiat diferit sau poate răspunde diferit în interfața MS. Cu toate acestea, este importantă înțelegerea chimiei metodei noastre analitice pentru a face alegeri critice cu privire la tipul și concentrația de tampon. Concentrațiile de analit și cantitatea de suprafață a coloanei care necesită controlul pH-ului sunt suficient de mici pentru a avea nevoie doar de o concentrație foarte mică de tampon pentru a menține timpi de retenție reproductibili, o formă acceptabilă a vârfurilor și o sensibilitate de detecție.
Figura 3 indică situațiile în care acetatul de amoniu poate fi util atât în cromatografie, cât și în spectrometria de masă.
Figura 3: Variația capacității de tampon pentru soluția apoasă de acetat de amoniu (10mM) cu diferite proporții de acetonitril (%) (Adaptat cu permisiunea din Ref. 2)
În esență, există două regiuni de tamponare atunci când se adaugă acetat de amoniu 10mM la soluția noastră de eluent și se utilizează fie amoniac diluat, fie acid formic pentru a ajusta pH-ul. Fără adăugarea acidului sau a bazei, soluția va avea o capacitate de tamponare foarte mică.
În soluție 100% apoasă, valorile pKa ale tamponului sunt în jur de 4,8 și 9,5. Tamponul se utilizează cel mai bine la aproximativ +/- 1 unitate de pH față de pKa tampon, unde capacitatea de tamponare se va reduce la aproximativ 66%. La o distanță de 2 unități de pH față de pKa al tamponului, capacitatea tamponului se reduce la aproximativ 5%. Pentru un tampon de acetat de amoniu în apă, pH-ul eluentului utilizat pentru separare trebuie să fie cuprins între 3,8 și 5,8 atunci când se utilizează acidul formic ca modificator de pH și între 8,5 și 10,5 atunci când se utilizează amoniac pentru a ajusta pH-ul eluentului. Atenție: odată ce acetonitrilul este adăugat în sistem, acest interval de lucru se schimbă și intervalul de pH utilizabil devine 5,2-7,2 sau 7,9-9,9 la 60% acetonitril. În cazul separărilor în gradient, pKa sistemului tampon se va modifica constant. PKa al sistemului la compoziția de pornire a gradientului este utilizat pentru a estima utilitatea tamponului pentru separare.
Vor fi aceste intervale de pH suficiente pentru a evita modificări ale gradului de ionizare a analitului sau modificări de protonare a coloanei? Aceasta este întrebarea cheie.
Pentru detecția MS, analiții ionogeni în formă ionizată vor avea ca rezultat o bună sensibilitate de detecție, gestionând în același timp retenția în fază inversă prin alegerea judicioasă a fazei staționare și a tipului și compoziției solventului organic. Dacă analitul este complet ionizat la intervalele de pH sugerate mai sus (și în figura 3), atunci vor rezulta performanțe bune de cromatografie și detecție. Rețineți din figura 1 că capacitatea tampon a sistemului se reduce pe măsură ce se adaugă acetonitril, capacitatea tampon scăzând la 30% din valoarea apoasă la 60% acetonitril. Principiul cheie al utilizării tamponului în LC-MS este de a utiliza cât mai puțin posibil pentru a menține reproductibilitatea timpului de retenție, forma acceptabilă a vârfurilor și sensibilitatea detectorului. Concentrația de tampon va influența în mod direct cantitatea de suprimare a ionilor întâlnită și, prin urmare, sensibilitatea metodei va fi direct afectată. Pentru a menține o bună capacitate de tamponare la concentrații mai mici de tampon, deseori ne propunem să lucrăm în limita a +/- 0,5 unități din pKa tamponului.
Tabelul 1 prezintă intervalele de pH recomandate în care vor fi utile tampoanele de acetat de amoniu.
| % MeCN | Locația maximă a capacității tampon (acid acetic / acetat) | Locația maximă a capacității tampon (amoniu / amoniac) | Capacitatea tamponului (% în raport cu o soluție 100% Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6,0 | 8,5 – 9,5 | 50 |
| 60 | 5,6 – 6,6 | 8,3 – 9,3 | 30 |
Tabelul 1: Domeniile de lucru recomandate pentru pH și capacitățile tampon relative orientative pentru sistemele de eluenți de acetat de amoniu 0,1mM (aq) / acetonitril.
Utilizați domeniile de tamponare din tabelul 1 pentru a selecta pH-ul eluentului în care analitul trebuie să fie ionizat 100%. Rețineți că concentrația tamponului utilizată pentru a obține aceste cifre este de 0,1mM – o alegere populară pentru concentrația tamponului atunci când se utilizează detecția MS. Pentru analiții bazici, sistemul tampon de acid acetic/acetat este obișnuit, iar pH-ul eluentului este, de obicei, cu mult sub pKa al analiților bazici, asigurându-se că aceștia sunt protonați în mod constant. Același lucru poate fi valabil și pentru analiții acizi cu sistemul amoniu/amoniac, unde analiții acizi ar trebui să fie toți complet deprotonați. Acest lucru va asigura că timpii de retenție sunt constanți, că formele vârfurilor sunt sănătoase și că sensibilitatea MS este optimizată din perspectiva chimiei metodei.
Există lacune mari în intervalele de tamponare eficiente pentru eluenții pe bază de acetat de amoniu. Adică, la o compoziție a eluentului de 20% acetronitril (sau la o compoziție a gradientului de pornire de 20% acetonitril), este probabil să existe o capacitate de tamponare mai mică (va trebui să se utilizeze concentrații mai mari de tampon) cu un pH al eluentului sub 4,2, între pH 5,2 și 9,0 sau peste 10,0. Există și alte metode în care pH-ul eluentului este ajustat în afara acestor intervale recomandate atunci când se utilizează tampoane de acetat de amoniu. Luați în considerare utilizarea unui sistem tampon diferit – sistemul formate/acid formic este o alegere populară la valori ale pH-ului eluentului sub 4,2.
Ar trebui să se utilizeze întotdeauna un tampon?
Dacă pH-ul eluentului este departe de pKa al analitului, mici modificări ale pH-ului eluentului vor avea un efect neglijabil asupra gradului de ionizare a analitului. În aceste condiții, utilizarea unui tampon poate fi inutilă. De exemplu, acizii acetici (precum și acizii formic, trifluoro și difluoroacetic) au o capacitate substanțială de “autotamponare” la un pH scăzut și oferă analitului bazic pKa >2 unități de pH mai mare și analitului acid pKa
Toate acestea presupunând că analiții bazici sunt analizați folosind un sistem de eluent acid și analiții acizi cu un sistem de eluent cu un pH mai bazic pentru a asigura o ionizare completă și o bună sensibilitate a electrospray MS. În cazul în care apar probleme legate de contrapresiunea instrumentului, de instabilitatea timpului de retenție sau de sensibilitatea de detecție MS, atunci ar putea fi util să se analizeze dacă este necesară o sare tampon. Utilizarea judicioasă a acizilor formic sau acetic sau a soluției de amoniac poate rezolva orice problemă.
În orice caz, acordați-vă timp pentru a înțelege chimia metodei în ceea ce privește pKa analitului dumneavoastră, pH-ul necesar al eluentului și alegerea sistemului tampon utilizat pentru a atinge și menține acest pH în sistem.
Pentru cei care nu au informații despre pKa analitului, există o serie de programe gratuite disponibile care fac o treabă rezonabilă de predicție a pKa analitului pe baza structurii. Utilizate pe scară largă în laboratoarele noastre sunt:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Dacă se dorește o înțelegere mai profundă a tampoanelor și a utilizării lor în cadrul HPLC și LC-MS, consultați articolele din referințele 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger and Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Efectul metodei de preparare a tamponului asupra repetabilității retenției, LCGC North America Volumul 37, Numărul 7, iulie 2019