3.1 Enzimele endogene ale peștilor

După cum s-a discutat mai sus, diverse enzime proteolitice se găsesc în viscere, în tractul digestiv și în țesutul muscular al peștilor.

Proteinazele endogene majore la hamsii au fost: proteinaza de tip tripsină, pepsina, chimotripsina, elastaza și aminopeptidaza (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Enzimele digestive de tripsină, chimotripsină și pepsină sunt considerate ca fiind cele trei enzime mai importante în comparație cu celelalte (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsina se găsește de obicei în stomacul peștilor și este o enzimă principală a sucurilor digestive (de la Parra et al., 2007). Tripsina este prezentă în viscere, caeca pilorică și splină (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Hepatopancreasul organelor digestive ale peștilor și crustaceelor conține atât activități de peptidază, cât și de protează, cum ar fi aminopeptidaza, proteazele gelatinolitice, tripsina și chimotripsina și proteazele colagenolitice (Sriket, 2014).

S-a constatat că cele mai multe activități de lipoliză și proteoliză în procesarea peda au fost înregistrate în intestin, în special la începutul procesului de fermentare; cu toate acestea, activitățile au scăzut rapid în timpul procesului (Irianto, 1990). Având în vedere că enzimele se găsesc în viscere și în tractul digestiv, eviscerarea joacă un rol important în determinarea ratei și tipului de degradare enzimatică care are loc. Produsele fermentate din pește prelucrate folosind peștele întreg vor avea caracteristici diferite față de cele fabricate din pește decapitat și eviscerat (Wheaton & Lawson, 1985). Activitatea enzimatică a majorității enzimelor viscerale și ale tractului digestiv din pește a avut cea mai mare activitate la valori apropiate de pH-ul neutru (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).

Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño și Toro (2004) au izolat o enzimă proteolitică acidă, care aparține clasei proteazelor aspartice, din viscerele de sardine. Enzima este asemănătoare cu pepsina II de la alte specii de pești și este stabilă la pH 3-6 și 45°C.

Ceca pilorică reprezintă organele care sunt sursa majoră de proteinaze alcaline. O enzimă asemănătoare tripsinei obținută din caeca pilorică de cod (G. morhua) a avut un punct izoelectric de 5,30 și 5,89 și a avut o compoziție de aminoacizi foarte asemănătoare cu cea a tripsinei bovine, dar s-a diferențiat prin faptul că avea o cantitate relativă mai mare de aminoacizi acizi și o cantitate mai mică de aminoacizi bazici. Enzima a hidrolizat, de asemenea, substraturi proteice de pește (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).

Trei proteinaze alcaline și două proteinaze acide au fost izolate din sardină. Fiecare dintre proteinazele alcaline a hidrolizat cazeina mai rapid decât alte proteine. O protează alcalină majoră (III) a hidrolizat proteinele sarcoplasmatice din sardine de cinci ori mai repede decât alte proteaze alcaline. Fiecare dintre cele două proteinaze acide a hidrolizat hemoglobina și mioglobina mai rapid decât celelalte proteine. După preincubarea cu 25% NaCl, o proteinază alcalină (III) și o proteinază acidă (II) au fost stabile, deși celelalte proteinaze au devenit instabile. Cele două proteinaze, proteinaza alcalină III și proteinaza acidă II, au fost, de asemenea, stabile timp de 3 luni după începerea producției de sos de pește. Activitatea proteolitică a fiecărei proteinaze alcaline și a proteinazei acide a fost puternic inhibată de mai mult de 15% NaCl; cu toate acestea, s-a observat o inhibiție minimă atunci când s-au folosit ca substrat proteinele din mușchiul sardinei (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).

Două aminopeptidaze (I și II) au fost extrase din organele interne degresate ale sardinei și purificate prin cromatografie DEAE-celuloză, filtrare pe gel pe Sephadex G-200 și focalizare izoelectrică. Preparatele finale ale enzimelor I și II au fost considerate aproape omogene prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă. Greutățile moleculare ale enzimelor I și II au fost determinate prin filtrare pe gel ca fiind de 370 000 și, respectiv, 320 000. Punctele izoelectrice au fost de 4,1 (I) și, respectiv, 4,8 (II). Ambele enzime au fost inhibate de EDTA și activate de Co++. Bestatina a putut inhiba enzima I, dar nu și enzima II. Enzimele I și II au hidrolizat rapid nu numai substraturile sintetice care conțin alanină sau leucină, ci și di-, tri- și tetra-alanină. Pe baza tuturor acestor caracteristici, aminopeptidazele din sardine se aseamănă cu alanina aminopeptidaza umană. Enzima I și-a păstrat mai mult de 70% din activitatea inițială în 15% NaCl, sugerând că enzima participă la hidroliza proteinelor și peptidelor de pește în timpul producerii sosului de pește (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).

Activitățile proteinazelor alcaline și acide au fost comparate cu tripsina și pepsina bovină și au arătat că, la fel ca tripsina bovină, proteinaza alcalină din caeca pilorică de sardine hidrolizează cazeina mai eficient decât alte substraturi proteice (Noda et al, 1982).

Enzimele țesutului muscular, în special catepsinele, peptidazele, transaminazele, amidazele, decarboxilazele de aminoacizi, dehidrogenazele glutamice și enzimele înrudite, se găsesc toate în țesutul muscular al peștilor (Chaveesuk, 1991), iar aceste enzime, în special tripsina, chimotripsina și catepsina, se implică în hidroliza proteinelor în timpul fermentării sosului de pește (Fernandes, 2016). Enzimele țesutului muscular sunt localizate în cea mai mare parte în celule. Pe de altă parte, enzimele digestive sunt secreții exocelulare. Chiar dacă unele studii au arătat că enzimele din țesutul muscular au o activitate optimă la pH neutru, majoritatea rapoartelor informează că valorile scăzute ale pH-ului accelerează activitățile enzimelor din țesutul muscular. Majoritatea produselor din pește fermentat sunt prelucrate la un pH de peste 4, cu excepția silozului de pește și a unor produse din pește fermentat. În consecință, majoritatea enzimelor din țesutul muscular nu sunt de fapt în condiții de pH optim (Mackie et al., 1971).

Caracterizarea parțială a catepsinelor B din mușchiul de stavrid negru a indicat caracteristici similare cu alte catepsine BS. pH-ul optim al catepsinei a fost de 5 cu o temperatură optimă de 50°C. Activitatea a fost inhibată de E-64, CA-074 și chymostatin (Yoshida et al., 2015).

Activitățile enzimatice maxime pot fi obținute prin utilizarea peștelui întreg, inclusiv capetele și viscerele. Dimpotrivă, o activitate enzimatică minimă va avea loc atunci când se utilizează pește decapitat și eviscerat pentru a produce produse fermentate din pește. Între timp, activități enzimatice intermediare pot fi obținute prin îndepărtarea intestinelor oricând după ce peștele este capturat pentru a permite o oarecare difuzie a enzimelor viscerale în țesuturi (Owens & Mendoza, 1985).

În peștele sărat, maturarea este descrisă de trei ipoteze. Acestea sunt: (1) teoria microbiologică, (2) teoria autolitică și (3) teoria enzimelor. În teoria microbiologică, microorganismele produc enzimele active esențiale, iar aceste enzime pătrund în carne și contribuie la procesul de maturare. Teoria autolitică descrie faptul că maturarea este un rezultat al activității enzimelor din mușchi sau alte țesuturi, sau din tractul gastrointestinal. În cele din urmă, teoria enzimatică explică maturarea peștelui sărat ca având loc sub influența anumitor enzime, și anume, cele conținute în țesutul muscular, cele din organele intestinale ale corpului peștelui, împreună cu cele produse de microorganisme (Mackie et al., 1971).

În maturarea hamsiei, activitatea autolitică maximă a hamsiei indiene (Stolephorus indicus) a fost găsită la 60°C. Activitatea autolitică a scăzut odată cu creșterea concentrației de NaCl. Extractul brut a prezentat un pH optim la 8,5-9,5. Proteinazele de tip tripsină au fost proteinele predominante în extractul brut. Proteinazele din hamsia indiană ar putea participa la hidroliza proteinelor în timpul fermentației sosului de pește. Prin urmare, incubarea hamsiei indiene la 60°C și în 10% NaCl pentru o perioadă de timp înainte de sărarea completă la 25% NaCl ar putea fi o modalitate eficientă de accelerare a procesului de fermentare a sosului de pește (Siringan et al., 2006).

.