Dr. Bang a fost foarte interesat de sistemele circulatorii ale nevertebratelor. El credea că studierea animalelor la care circulația putea fi observată ar duce la o mai bună înțelegere a proceselor fiziologice de la vertebrate, cum ar fi oamenii.
La începutul anilor 1950, în timp ce se afla la Laboratorul de Biologie Marină din Wood’s Hole, Maine, Bang a studiat sistemul circulator al crabului potcoavă și răspunsul acestuia la o infecție bacteriană.
El injecta bacterii obținute din apă dulce de mare în crabi potcoavă de diferite mărimi și le studia reacția. De obicei, sângele forma un mic cheag pentru a sigila zona infectată și a împiedica pătrunderea altor bacterii.
Dar, într-o zi, Bang a observat că unul dintre crabii săi a murit din cauza unei infecții necunoscute care făcuse ca aproape tot volumul de sânge din crab să se coaguleze într-o masă semisolidă.
Nu se mai văzuse așa ceva până atunci!
Așa că a izolat și a cultivat bacteria de la primul animal și a injectat-o în alți crabi potcoavă. Aceștia au prezentat, de asemenea, o coagulare identică și au murit.
Investigând mai departe, a descoperit că numai bacteriile “Gram-negative” produc această reacție.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Bacteriile Gram-negative provoacă infecții precum pneumonia și meningita. Când Bang a omorât termic bacteriile înainte de injectare, tot a obținut aceeași reacție de coagulare. Acest lucru însemna că nu era nevoie de bacterii vii pentru a provoca coagularea sângelui crabului potcoavă.
Și-a publicat descoperirile în 1956 și a lăsat deoparte observațiile sale inițiale timp de aproape 10 ani.
Intra Jack Levin.
În 1963, în timp ce Bang discuta datele din proiectul său cu crabul potcoavă, un coleg a sugerat că o colaborare cu un hematolog ar putea ajuta la deslușirea misterului coagulării. Colegul i-a recomandat un coleg de cercetare din laboratorul său, Dr. Jack Levin.
Levin folosea iepuri pentru a studia Reacția Shwartzman – reacția la endotoxine care determină formarea unui cheag în interiorul unui vas de sânge și care, de asemenea, alterează funcția trombocitelor vertebratelor.
Endotoxina este o componentă cheie în peretele celular al tuturor bacteriilor Gram-negative; poate fi greu de detectat și este rezistentă la medicamente.
Bang l-a convins pe Levin să petreacă o vară la Laboratorul de Biologie Marină din Woods Hole, unde a studiat asemănările dintre amebocitele Limulus și trombocitele umane.
A demonstrat rapid că plasma fără celule de la un crab potcoavă nu se coagulează, dar când a studiat celulele sanguine a avut probleme în a împiedica sângele să se coaguleze.
Avea și o altă problemă. Probele care erau în regulă când a părăsit laboratorul seara erau coagulate când s-a întors dimineața, și niciunul dintre anticoagulantele de pe piață nu făcea vreo diferență.
Serendipity Leads to an Aha! Moment
Levin era nedumerit și începea să devină cam disperat să își dea seama ce se întâmplă!
S-ar putea fi din cauza bacteriilor sau a unei componente a bacteriilor?
Pentru a testa această posibilitate, a pregătit noi probe în sticlărie sterilă, fără endotoxine. În mod uimitor, sângele nu s-a coagulat!
Atunci și-a dat seama că identificase un mecanism de coagulare a sângelui care era declanșat de prezența endotoxinei bacteriene gram-negative.
În cele din urmă, a reușit să demonstreze că întregul mecanism de coagulare a sângelui la Limulus era conținut în amebocite și era extrem de sensibil la prezența endotoxinelor.
Amebocitele Limulus polyphemus
“Cred că numai un cercetător care lucra cu endotoxine ar fi luat vreodată în considerare posibilitatea ca endotoxina să provoace coagularea sângelui Limulus”, spune Levin.
Aceasta a dus la crearea și brevetarea de către Levin a testului extrem de sensibil Limulus Amebocyte Lysate (LAL), care putea testa endotoxinele bacteriene folosind sângele de crab potcoavă.
Singurul alt test pentru endotoxine de la acea vreme se numea Rabbit Pyrogen Test. La acea vreme, US Food and Drug Administration cerea ca toate medicamentele injectabile să treacă testul Pyrogen înainte de a putea fi aprobate pentru utilizare.
Cu toate acestea, testul Rabbit Pyrogen era un proces costisitor, ineficient și adesea inexact.
Se injectează proba într-un grup de iepuri. Dacă acei iepuri făceau febră la acei iepuri, medicamentul nu trecea testul. Dacă nu făceau febră în 4-6 ore, medicamentul trecea.
Companii farmaceutice trebuiau să găzduiască mii de iepuri pentru a efectua aceste teste.
Testul LAL poate returna un rezultat în doar 45 de minute și poate detecta prezența endotoxinelor la niveluri mai mici de o parte pe trilion.
Levin și-a dat seama că avea un test foarte sensibil și rapid! Acesta a fost o concurență acerbă pentru testul la iepure.
Testul LAL poate returna un rezultat în doar 45 de minute și poate detecta prezența endotoxinelor la niveluri de mai puțin de o parte pe trilion.
Deși testul LAL a fost descris pentru prima dată în 1965, a durat aproape 20 de ani până când testul a fost aprobat în mod oficial ca test de endotoxine pentru produse finite de către FDA!
De ce a durat atât de mult?!
Să recunoaștem, oamenilor nu le place să schimbe lucrurile, iar companiile rezistă cu adevărat schimbărilor. Adoptarea noului test, mai sensibil, a însemnat că firmele farmaceutice ar trebui să se retehnologizeze și să înființeze o întreagă linie de producție nouă.
Este vorba de timp și bani!
Dar crema se ridică în cele din urmă în vârf; acest test a fost crema recoltei și încă este!
Cerința pentru LAL este acum atât de mare încât a devenit unul dintre cele mai valoroase lichide de pe Pământ, cu un preț raportat în aprilie 2018 între 35.000 și 60.000 de dolari pe galon!
Extinderea testului LAL
Testul LAL a fost numit una dintre “Cele mai importante 100 de contribuții la sănătatea publică” de către Școala de sănătate publică Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
Potrivit lui Jack Levin, este testul standard de depistare a contaminării cu endotoxine la nivel mondial, cu aproximativ 17,5 milioane de probe testate (ceea ce înseamnă aproximativ 70 de milioane de teste efectuate) în fiecare an. Este utilizat în comerț pentru a testa toate fluidele intravenoase, medicamentele parenterale și dispozitivele medicale implantabile înainte de a fi utilizate la pacienți.
Cum se face LAL?
Crabii potcoavă sunt capturați și un tub este înfipt în ei pentru a le sifona sângele (vezi imaginea de mai sus). Apoi, sângele colectat este centrifugat pentru a concentra amebocitele. Adăugarea de apă la amebocitele împachetate face ca acestea să se descompună și să elibereze proteinele de coagulare (lizatul) care reacționează cu endotoxinele.
Acest mod de a face LAL este prezentat ca o metodă neletală de obținere a sângelui de la crab. Dar nu este așa. Pentru că nu toți crabii supraviețuiesc!
Potrivit Atlantic State Marine Fisheries Commission, în raportul de evaluare a stocului de referință de crabi Horseshoe Crab din 2019 și în raportul de evaluare inter pares, 600.000 de crabi Horseshoe sunt capturați și sângerate pentru a satisface cererea anuală de LAL.
Dintre acești 600.000 de crabi, aproximativ 420-540.000 (70-90 %) supraviețuiesc procedurii. Cuplați acest lucru cu invadarea habitatului, încălzirea globală și alți 500.000 + recoltați și uciși în fiecare an pentru a fi folosiți ca momeală pentru pescuitul de anghilă și de bibilică și puteți vedea de ce populațiile de crabi potcoavă sunt în scădere.
Nu numai atât, dar crabii sunt recoltați în lunile mai și iunie, când vin la țărm în masă pentru a se împerechea, pentru a-și depune ouăle și pentru a spera să-și mențină supraviețuirea.
Aceasta nu este o situație sustenabilă!
Există modalități mai bune de a face LAL?
“Crabul american cu potcoavă a supraviețuit dinozaurilor și a supraviețuit celor patru extincții în masă anterioare, dar acum este amenințat de industria farmaceutică, de comunitățile de pescari, de pierderea habitatului, de schimbările climatice și, cel mai recent, de valurile sufocante de alge roșii de pe coasta de est a Statelor Unite.” din Jonathan Watts în The Guardian
Există două eforturi principale care sunt prezentate ca modalități de atenuare a acestei situații nefericite.
O abordare încercată de industria farmaceutică este acvacultura crabilor cu potcoavă.
Început, încercările de a cultiva crabi cu potcoavă nu au avut prea mult succes. Se pare că, după 3-4 luni de cultură, concentrațiile de proteine din hemolimfă au scăzut la niveluri care duc la mortalitate. Se credea că aceste decese erau legate de deficiențe nutriționale.
Dr. Anthony Dellinger este profesor la departamentul de neuroștiințe al Universității din Carolina de Nord la Greensboro și om de știință la Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger și KBI au lucrat din greu la dezvoltarea unui sistem de acvacultură nou și îmbunătățit. Premisa lor este că “colectarea controlată de LAL de la crabi potcoavă monitorizați și bine întreținuți în acvacultură ar putea crește cantitățile de LAL furnizate, ar asigura viabilitatea speciei și ar permite noi inovații clinice.”
Dacă va avea succes, producerea unor volume mai mari de LAL în mod fiabil, durabil și economic ar fi benefică atât pentru natură, cât și pentru industrie.
Dellinger și colegii săi au descris în detaliu modul în care funcționează sistemul lor de acvacultură într-o lucrare publicată în Frontiers of Marine Science în luna aprilie a anului trecut.
Să ne uităm la punctele culminante și la rezultatele acelui studiu.
În primul rând, au optimizat un sistem de acvacultură cu recirculare în interior care menține în mod fiabil crabii potcoavă. Scopul lor a fost de a facilita recoltarea repetitivă a LAL, menținând în același timp bunăstarea animalelor.
Următoarea etapă a fost realizarea unei metode de recoltare repetitivă cu impact redus. Pentru a face acest lucru, ei au implantat chirurgical un cateter în crabul potcoavă. Toate testele lor au arătat că crabii potcoavă au tolerat destul de bine aceste catetere.
Iată un scurt rezumat al rezultatelor lor.
Au recoltat și menținut 24 de crabi timp de un an cu o supraviețuire de 100%. Crabii potcoavă au fost verificați pentru activitatea LAL, eliberarea de ovule și spermatozoizi și alte semne care ar putea indica o sănătate afectată. Nu au fost observate astfel de semne.
Crabii au sângerat din catetere de aproximativ trei ori pe lună, ceea ce echivalează, potențial, cu aproximativ 36 de sângerări pe crab în perioada de 12 luni. Nu au fost întâlnite probleme de la cateterele implantate în această perioadă de timp.
Când au calculat costurile suportate, în afara amenajării inițiale pentru sistemul de acvacultură, întreținerea crabilor a ajuns la aproximativ 0,76 dolari pe kilogram, o sumă foarte accesibilă!
Cea mai importantă întrebare la care trebuia să se răspundă a fost:
Cum se compară LAL de la crabii potcoavă întreținuți în gospodărie cu cea obținută de la crabii proaspăt recoltați?
Așa cum se arată în figura 6 din lucrarea lor, nu a existat nicio diferență semnificativă în activitatea de coagulare a endotoxinei LAL între crabii de acvacultură și crabii sălbatici. Și, de asemenea, nu a existat nicio diferență reală în activitatea din sângerările prelevate în zilele 1, 16 și 23.
Aceste rezultate i-au determinat să concluzioneze,
“…acvacultura ar putea satisface nevoile industriei timp de mai mulți ani cu echivalentul a 5-10% din captura anuală a unui an, lăsând aproape 600.000 de HSC în sălbăticie în fiecare an ulterior. De fapt, aceste constatări sugerează că ∼60.000 de HSC de acvacultură ar putea fi sângerate în mod sustenabil de 12-24 de ori pe an și ar putea depăși cererea actuală de LAL biomedicale.”
A doua abordare elimină complet nevoia de crabi.
Jeak Ling Ding, împreună cu soțul și partenerul ei de cercetare Bow Ho, din Singapore, au avut un obiectiv – să elimine complet nevoia de crabi cu potcoavă.
Ea studia Carcinoscorpius rotundicauda, o specie asiatică mult mai mică decât crabii cu potcoavă din Atlantic, iar aceștia nu puteau fi sângerați prea mult fără să moară.
Cercetările lui Ding asupra LAL au dus la descoperirea faptului că o moleculă numită factor C era responsabilă pentru acțiunea sa de coagulare. Ding a izolat gena pentru factorul C și a folosit un virus pentru a o insera în celulele intestinale ale insectelor. Acest lucru a transformat, în esență, insectele în mici fabrici care produceau factorul C.
Insectele modificate produc cantități suficiente de factor C, care ar putea fi apoi vândut ca factor C recombinant* (rFC) pe piață ca un înlocuitor viabil al LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Acum, în loc să recolteze sau să acvaculeze crabi potcoavă și să îi sângereze, ei ar putea crește cantități mari de insecte și să izoleze rFC.
Companii farmaceutice care au folosit rFC au confirmat că funcționează la fel de bine ca LAL, iar costurile de producție sunt comparabile.
“Am fost atât de entuziasmați ca cercetători, atât de fericiți că funcționează”, a spus Ding. “Și ne-am gândit că factorul C recombinant va fi adoptat în întreaga lume, iar crabul potcoavă va fi salvat.”
Din păcate, rFC s-a confruntat cu aceleași obstacole în calea adoptării ca și LAL atunci când a fost introdus. Deși rFC se află pe piață din 2003, a fost lent să câștige teren. Dar, încetul cu încetul, acesta depășește obstacolele în calea aprobării sale de către FDA. Inițial, un singur producător îl producea – compania de produse chimice cu sediul în Elveția, Lonza Group.
În 2013, Hyglos GmbH a devenit a doua companie care produce rFC. Kevin Williams, om de știință senior la Hyglos, spune că, în opinia sa, adoptarea și aprobarea rFC ar fi trebuit să aibă loc cu mult timp în urmă. Hyglos GmbH a obținut aprobarea pentru utilizarea sa de către mai multe agenții europene de reglementare.
Astăzi, experții cred că, în cele din urmă, rFC va deveni metoda dominantă de detectare a endotoxinelor, lăsând crabii potcoavă complet în afara producției industriale.
Acum este ceva cu care crabii potcoavă pot trăi!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Ceea ce ne aduce la ultima întrebare pe care vreau să o analizez:
De ce ne pasă dacă crabii potcoavă supraviețuiesc, oricum?
Nu sunt ei doar niște relicve antice de care ecosistemul nostru modern s-ar putea descurca cu ușurință fără? O mulțime de alte specii au dispărut și planeta pare destul de ok.
Este o întrebare validă, așa că haideți să o analizăm un pic mai în profunzime.
Răspunsul instinctiv este: “bineînțeles că vrem să-i salvăm!”. Avem destule creaturi pe această planetă deja amenințate sau care au dispărut deja. Pur și simplu nu ne putem permite să mai pierdem și altele.
Cum am spus, aceasta este mai mult o reacție instinctivă, nu un răspuns pe care să-ți poți pune pălăria. Pentru un răspuns mai bun, trebuie să ne uităm la modul în care crabii potcoavă se încadrează în imaginea de ansamblu.
Să începem cu ceea ce mănâncă și cu ceea ce îi mănâncă.
Crabul potcoavă adult se hrănește cu moluște mici, cum ar fi midia albastră și scoica, precum și cu viermi aneliți.
În 2017, midiile albastre nu sunt în pericol serios, potrivit acestui raport al Centrului Safina de la Universitatea Stony Brook. Același lucru este valabil atât pentru aneliide, cât și pentru scoicile de suprafață.
Juvenii se hrănesc cu particule mici atât de alge, cât și de materie animală. Pe măsură ce animalul crește în dimensiune, la fel se întâmplă și cu prada pe care o consumă.
În ansamblu, se pare că crabii potcoavă nu au efecte dăunătoare asupra speciilor lor de pradă.
Ok, aceasta este o față a monedei. Cum rămâne cu cealaltă? Ce mănâncă crabii potcoavă?
Ouăle de crab potcoavă sunt o sursă de hrană pentru multe organisme.
Acestea includ păsări de țărm, unii pești – biban dungat, bibanul dungat, argintii, plătica – precum și țestoase de mare, crabi și bibilici. Acestea reprezintă o sursă de hrană esențială pentru 11 specii de păsări de țărm migratoare. Pierderea acestor ouă ar devasta aceste populații de păsări.
Testoasele de mare cu cap pătrat și păsările de țărm, cum ar fi crabul roșu, depind de crabii potcoavă.
Mii de aceste broaște țestoase migrează vara în Golful Chesapeake și Delaware pentru a se hrăni cu crabi. În prezent, se crede că țestoasele cu cap pătrat suferă din cauza lipsei crabilor potcoavă din Chesapeake.
Câteva anecdote relatează că crabii potcoavă apar în burțile aligatorilor și rechinilor.
Puii de crab potcoavă ar putea fi, de asemenea, o hrană esențială în rețeaua alimentară de coastă. De-a lungul verii și toamnei, crabii potcoavă în stadii larvare și în stadii incipiente de viață mișună în apele puțin adânci. Aceste bucățele sunt, fără îndoială, înghițite și de pești și de păsările de țărm.
Și se pare că există o mulțime de alte animale care le găsesc destul de gustoase și cărora le-ar fi greu să găsească înlocuitori ușori.
Pentru o creatură care există de 450 de milioane de ani, înțelegerea noastră este departe de a fi completă în ceea ce privește rolul pe care Limulus polyphemus îl joacă în ecosistemul de coastă.
În stadiul actual al cunoștințelor noastre despre ecologia crabilor potcoavă, nu putem ajunge definitiv la nicio concluzie cu privire la cât de esențial este rolul lor. Ceea ce putem spune este că ei ocupă cu siguranță o nișă care merită un studiu mai serios.
Chiar și așa, eu mă situez de partea necesității de a-i conserva! Este atitudinea mea “mai bine să fiu sigur decât să regret”. Pur și simplu știm prea puțin pentru a lăsa o specie precum Limulus polyphemus să ne scape printre degete și să dispară dacă putem împiedica acest lucru.
Acum, puteți face ceva?
Dacă se întâmplă să locuiți în apropierea unui loc unde crabii potcoavă vin să depună ouă, este ușor să vă aruncați și să ajutați. Există programe de întoarcere a crabilor și de cercetare a crabilor de reproducere care se bazează pe voluntari.
Și, în final, amintiți-vă de crabul potcoavă atunci când mergeți la doctor. Orice lucru injectat sau implantat în corpul nostru este în continuare testat pentru contaminarea cu bacterii gram-negative cu LAL făcut din sânge de crab potcoavă.
Până data viitoare
Rich
Ei! Dacă ți-a plăcut acest articol, atunci abonează-te la newsletter-ul meu și primește un ebook gratuit!
Sursele de informații folosite pentru acest articol:
- Crabul potcoavă
- Acvacultura crabilor potcoavă ca sursă sustenabilă de testare a endotoxinelor
- Rolul crabilor potcoavă în industria biomedicală și tendințele recente care au impact asupra sustenabilității speciei
- Ultimele zile ale crabului albastru…Blood Harvest
- Acest crab ar putea să vă salveze viața – dacă oamenii nu-l extermină mai întâi
- NJ a pus capăt recoltării crabilor potcoavă. Ar trebui ca și alte state să facă același lucru?
- Site-ul Horseshoe Crab creat de Kayla Westerlund
- Crabul cu potcoavă din Atlantic
Secretele subacvatice ale crabilor potcoavă
.