în anii 1960, au fost atinse două repere în fiziologia absorbției intestinale a zahărului. Primul a fost ipoteza cotransportului Na+-glucoză a lui Crane și a colegilor (1), care a explicat transportul activ al zahărului, iar al doilea a fost descoperirea malabsorbției de glucoză și galactoză (GGM) la pacienți (5, 6). Ipoteza cotransportului a fost testată exhaustiv, confirmată și extinsă pentru a include “transportul activ” al unei mari varietăți de substraturi în celule, de la acumularea lactozei în Escherichia coli la acumularea de iodură în glanda tiroidă. În esență, cotransportatorii sunt mașini moleculare care utilizează energia stocată sub formă de gradienți de potențial electrochimic al ionilor prin membranele celulare, Na+ sau H+, pentru a conduce acumularea de soluturi specifici și apă în celule (22). Cotransportatorul intestinal Na+-glucoză (SGLT1) utilizează Na+ și gradienți electrici de-a lungul membranei pentru a conduce zahărul și apa în enterocite împotriva gradientului de concentrație al acestora (9, 13, 23). Atât glucoza, cât și galactoza sunt manipulate de SGLT1, în timp ce fructoza este transportată peste marginea periei de către propriul său transportator privat, transportatorul facilitat de fructoză (GLUT5). Glucoza, galactoza și fructoza își termină călătoria prin celulă până în sânge prin intermediul unui alt transportor de zahăr facilitat (GLUT2) din membrana bazolaterală (Fig.1).

GGM se caracterizează prin debutul neonatal al diareei severe apoase și acide, care este fatală în câteva săptămâni, cu excepția cazului în care lactoza (glucoza și galactoza) este eliminată din alimentație (2). Diareea încetează odată cu postul sau cu retragerea din alimentație a zaharurilor incriminate, dar se reia imediat cu alimentația orală cu diete care conțin lactoză, glucoză sau galactoză. Absorbția fructozei nu este afectată. Având în vedere simptomele bolii și ceea ce se știa la acea vreme despre absorbția intestinală a zahărului, s-a prezis că GGM se datorează unui defect al cotransportatorului Na+-glucoză de la marginea periei. Această ipoteză a fost întărită de experimentele rafinate de absorbție autoradiografică a galactozei și de legare a florizinei efectuate pe biopsii mucoase de la primul pacient american cu GGM (17, 18). Aceste experimente au arătat că reducerea transportului de galactoză a fost asociată cu o scădere de 90% a legării florizinei la marginea perilor. Florizina este un inhibitor specific, netransportat, competitiv al SGLT1.

Cel mai fiabil test de diagnostic pentru GGM este testul respirator H2 (Fig.2). Administrarea orală de glucoză sau galactoză (2 g/kg) determină o creștere a H2 în aerul expirat cu mult peste 20 părți/milioane la pacienții cu GGM, dar nu are loc o astfel de creștere la martori sau la pacienții hrăniți cu fructoză. Copiii cu GGM se dezvoltă “normal” cu formule de înlocuire a fructozei, dar simptomele revin chiar și la vârsta adultă cu doar o linguriță de glucoză (6 g), iar testul respirator H2 rămâne pozitiv. Boala este destul de rară. Cunoaștem aproximativ 200 de pacienți din întreaga lume, iar o proporție mare de cazuri provin din relații consangvine.

Fiziologia și fiziopatologia absorbției intestinale a zahărului au avansat în 1987 prin clonarea de către noi a cotransportatorului Na+-glucoză de iepure printr-o strategie nouă pe care am numit-o “clonare de expresie”. Acest succes a fost urmat rapid de clonarea de către Turk și Hediger (4) a cotransportatorului uman de Na+-glucoză și de identificarea de către Turk și colab. (20) a primei mutații într-un transportor care a provocat o boală genetică, GGM. Am obținut biopsii intestinale de la două surori diagnosticate cu GGM și probe de sânge de la părinți, care sunt verișori. Turk et al. (20) au identificat o mutație homozigotă, missense (Asp28Asn) în ADNc al SGLT1 de la fiecare soră, au constatat că fiecare părinte era purtător al acestei mutații și au demonstrat că, într-adevăr, mutația abolește complet cotransportul Na+-glucoză folosind un test de expresie a ovocitelor. În aceeași familie, s-a efectuat ulterior un screening prenatal pe doi fetuși și s-a constatat că unul dintre ei (fratele probandului) era purtător al mutației Asp28Asn, iar celălalt (un văr) era normal. Ambii copii au prosperat fără restricție alimentară și au rămas asimptomatici timp de cel puțin doi ani (11).

Progresele ulterioare au fost împiedicate inițial de dificultatea de a obține probe de biopsie a mucoaselor de la copii cu GGM până când Turk și colab. (21) au reușit să cartografieze întreaga genă umană SGLT1. Gena este mare, cu 15 exoni distribuiți pe 72 kb de ADN. După secvențierea exonilor și a regiunilor flancate de aceștia, a fost dezvoltat un test de polimorfism conformațional monocatenar pentru depistarea mutațiilor la pacienți folosind ADN genomic dintr-o mică probă de sânge. Această dezvoltare a implicat amplificarea prin PCR a fiecăruia dintre cei 15 exoni și a joncțiunilor intron-exon ale acestora și electroforeza pe gel a produselor PCR denaturate pentru a identifica exonii purtători de mutații. Exonii anormali au fost apoi secvențiați. Pentru a determina dacă mutațiile erau responsabile de defectul de transport al zahărului, s-au exprimat mutanții în ovocite Xenopus laevis pentru testele de absorbție a Na+-glucozei. Martı́n (Refs. 10, 12 și observații nepublicate) a fost în mare măsură responsabil pentru această fază a proiectului. Mutațiile care explică boala au fost identificate la 33 din cei 34 de pacienți GGM examinați. Pacienții din 17 rase purtau mutații homozigote, iar, în alte 10 rase, pacienții aveau mutații heterozigote compuse. Acestea au inclus 22 de mutații cu sens greșit (a se vedea Fig.3) și 4 mutații de tip splice-site și 3 mutații fără sens care au ca rezultat producerea unei proteine SGLT1 sever trunchiate. Eșecul de a detecta mutații la cel de-al 34-lea pacient se poate datora faptului că mutația se afla în regiunea promotoare a genei, iar ADN-ul din această zonă nu a fost inclus în procedura de screening.

În calitate de fiziolog în domeniul transportului, am fost interesat de mutațiile missense GGM din cauza potențialului lor de identificare a reziduurilor din proteină critice pentru transport. Prin urmare, ne-am propus să determinăm modul în care mutațiile missense cauzează, de fapt, defectul în transportul Na+-zahăr. În acest demers, realizat în mare parte de Lostao (a se vedea Refs. 10 și 12), au fost exprimate proteinele mutante în ovocite X. laeviso și apoi au fost utilizate metode biofizice și biochimice pentru a determina nivelul de proteină în celulă și în membrana plasmatică. În cazurile în care transportorul a fost inserat în membrana plasmatică, noi (7) am examinat reacțiile parțiale ale ciclului de transport. Inițial, am fost dezamăgiți să constatăm că, în cazul primilor 21 de mutanți missense studiați, defectul principal se datora unui mistrafficking al transportatorilor în celulă. Pe baza Western blots, toți mutanții au fost sintetizați la niveluri similare sau mai mari decât SGLT de tip sălbatic. Cu toate acestea, măsurătorile de sarcină (7) și microscopia electronică prin frecare prin congelare (24) a membranei plasmatice a oocitelor au demonstrat că a existat o reducere severă a numărului de cotransportatori în membrana plasmatică (10, 12). După cum reiese din gradul de glicozilare centrală și complexă a mutanților, defectul de trafic al SGLT1 către membrana plasmatică s-a produs fie între reticulul endoplasmatic și Golgi, fie între Golgi și membrana plasmatică. Plierea incorectă a proteinelor mutante poate fi cauza primară a ratarea transportorului (19). Într-un singur caz, Gln457Arg, proteina mutantă a fost în membrana plasmatică a oocitelor aproape de nivelurile normale.

Ce relevanță au aceste experimente pe ovocite pentru intestinele pacienților cu GGM? Pentru a răspunde la această întrebare, am examinat (date nepublicate) distribuția proteinei SGLT1 prin imunocitochimie în biopsiile mucoasei de la trei pacienți cu mutații homozigote. La toți trei, distribuția proteinelor mutante în ovocite a fost identică cu distribuția SGLT1 în enterocitele pacienților: la doi dintre ei, proteina se afla în citoplasmă, iar la unul dintre ei, proteina se afla în marginea perie. Există, de asemenea, concordanță între rezultatele noastre pe ovocite și cele obținute prin studii autoradiografice ale biopsiilor de la primul pacient american cu GGM (18). Stirling și colaboratorii săi (18) au constatat că legarea florizinei la bordura în perie a pacientului a fost redusă cu 90%, iar noi nu am găsit nicio proteină SGLT1 mutantă (Cys355Ser și Leu147Arg) în membrana plasmatică a ovocitelor (10). Aceste studii sugerează că, cel puțin în cazul acestor patru mutanți GGM, ovocitele recapitulează comportamentul proteinei mutante în enterocit.

O întrebare majoră rămasă este modul în care mutațiile missense distribuite în întreaga proteină (Fig. 3) perturbă traficul transportatorului către membrana plasmatică. Răspunsurile la această întrebare sunt importante pentru înțelegerea biosintezei proteinelor membranei plasmatice și pentru conceperea unor terapii îmbunătățite pentru copiii cu GGM.

Mutația GGM într-un singur neam, Gln457Arg, a oferit o perspectivă neprețuită asupra mecanismului de transport al zahărului. Lostao a studiat (în pregătire) comportamentul SGLT1 Q457R exprimat în ovocite și în mucoasa intestinală a pacientului și a constatat că proteina este tradusă, glicozilată și inserată în membrana plasmatică, dar nu este capabilă să transporte zahăr. În absența zahărului, proteina mutantă transportă Na+ pe calea scurgerii Na+ sau a uniportului Na+, iar acest lucru este blocat de clorizină. Glucoza este, de asemenea, un inhibitor deoarece blochează, de asemenea, această cale de transport al Na+, ceea ce indică faptul că glucoza se leagă de SGLT1 Q457R, dar nu este transportată, adică mutația produce un defect de translocare a zahărului. Panayotova-Heiermann și colegii (15) au demonstrat în mod independent că “porul” zahărului prin SGLT1 este format de domeniul COOH-terminal al SGLT1 care poartă reziduul Q457.

Pentru a exploata aceste observații, am examinat rolul lui Q457 în translocarea zahărului. În acest studiu, s-a constatat că mutantul de cisteină Q457C păstrează o activitate completă de transport Na+-glucoză, în afară de o creștere a constantei Michaelis-Menten aparentă a glucozei (Km) de la 0,4 la 6 mM, iar mutageneza chimică a lui Q457C cu reactivi alchilanți încărcați sau neutri (metanethiosulfonate, MTS) s-a dovedit a bloca complet transportul de zahăr. Cu toate acestea, deoarece proteina Q457C alchilată leagă glucoza cu o constantă de disociere foarte asemănătoare cu Km aparent pentru transportul zahărului de către SGLT1 Q457C, acest reziduu nu trebuie să facă parte din situsul de legare a zahărului. Inhibarea transportului de zahăr de către Q457C prin MTS a avut loc numai atunci când cotransportatorul se afla în conformația Na+ orientată spre exterior, C2 (figura 4). Reactivul nu a fost eficient în absența Na+, în prezența Na+ și a glucozei (sau a florizinei), sau în prezența Na+ la potențiale de membrană depolarizate. Experimentele de salt de tensiune cu Q457C marcat cu rodamină au arătat, de asemenea, că evoluția în timp și nivelul de fluorescență au urmărit îndeaproape tranziția cotransportatorului între conformațiile C2 și C6 (Fig. 4). Interpretăm aceste rezultate ca însemnând că cotransportatorul poate exista în cel puțin trei conformații diferite (C6, C2 și C3) și că cuplarea dintre transportul de Na+ și de zahăr are loc prin modificări conformaționale ale proteinei induse de ligand și de voltaj.

Studii preliminare cu alte două mutații missense GGM în domeniul COOH-terminal al SGLT1, A468V și R499H (Fig. 3), arată că înlocuirea reziduurilor cu cisteine restabilește traficul proteinei către membrana plasmatică a ovocitelor. Ambele proteine sunt funcționale, iar transportul de zahăr este blocat de reactivii MTS. Ca și în cazul Q457C, aceste reziduuri sunt accesibile reactivilor MTS numai atunci când proteinele se află în conformația C2. Aceste rezultate susțin opinia mea conform căreia elicele transmembranare 10-13 (figura 3) formează porul de zahăr. Sunt necesare lucrări suplimentare pentru a identifica porul Na+.

În rezumat, studiile de biologie moleculară asupra SGLT1 au dus la clonarea ADNc pentru SGLT1 uman și la cartografierea genei, care au oferit noi instrumente puternice pentru a examina fiziologia cotransportului Na+-glucoză și pentru a studia GGM. S-a confirmat faptul că GGM se datorează mutațiilor în gena SGLT1, iar majoritatea acestor mutații au ca rezultat fie o proteină SGLT1 trunchiată, fie o distorsionare a transportorului în celulă. Așa cum se anticipează pentru o boală autosomal recesivă, o mutație privată produce boala în fiecare rudă, iar frecvența bolii crește în culturile cu o frecvență ridicată a căsătoriilor consangvine. Deși GGM este rară, este posibil ca grupul mai mare de indivizi purtători de mutații ușoare ale SGLT1 sau de mutații severe pe o singură alelă să aibă o absorbție deficitară a glucozei și galactozei. Aproximativ 10% din populația normală, studenți la medicină, au dat teste de respirație H2 pozitive la glucoză (14). Această interfață între fiziologie și boală nu numai că a sporit înțelegerea fiziopatologiei absorbției zahărului, dar a oferit noi abordări pentru a studia mecanismele moleculare ale cuplării dintre Na+ și transportul de zahăr prin membranele plasmatice.

FOOTNOTES

• * Primul dintr-o serie de articole invitate despre Tulburările genetice ale transportului membranar.

.