ImunohistochimieEdit

Imunohistochimia sau colorarea IHC a secțiunilor de țesut (sau imunocitochimia, care este colorarea celulelor), este probabil cea mai frecvent aplicată tehnică de imunomarcație. În timp ce primele cazuri de colorare IHC au folosit coloranți fluorescenți (a se vedea imunofluorescență), în prezent se folosesc alte metode non-fluorescente care utilizează enzime precum peroxidaza (a se vedea colorarea cu imunoperoxidază) și fosfataza alcalină. Aceste enzime sunt capabile să catalizeze reacții care dau un produs colorat ușor detectabil prin microscopie optică. Alternativ, se pot folosi elemente radioactive ca markere, iar imunoreacția poate fi vizualizată prin autoradiografie.

Prepararea sau fixarea țesuturilor este esențială pentru conservarea morfologiei celulare și a arhitecturii tisulare. O fixare necorespunzătoare sau prelungită poate diminua semnificativ capacitatea de legare a anticorpilor. Multe antigene pot fi demonstrate cu succes în secțiuni de țesut fixate în formol și încorporate în parafină. Cu toate acestea, unii antigeni nu vor supraviețui nici măcar unor cantități moderate de fixare cu aldehide. În aceste condiții, țesuturile trebuie congelate rapid în azot lichid și tăiate cu un criostat. Dezavantajele secțiunilor congelate includ morfologia slabă, rezoluția slabă la măriri mai mari, dificultatea de a tăia peste secțiunile de parafină și necesitatea depozitării la congelare. În mod alternativ, secțiunile vibratomei nu necesită ca țesutul să fie prelucrat prin solvenți organici sau căldură ridicată, care pot distruge antigenitatea, sau să fie perturbat prin decongelare. Dezavantajul secțiunilor cu vibratomul este că procesul de secționare este lent și dificil în cazul țesuturilor moi și slab fixate și că pe secțiuni sunt deseori vizibile urme de frecare sau linii de vibratom.

Dezvăluirea multor antigene poate fi îmbunătățită în mod dramatic prin metode de recuperare a antigenului care acționează prin ruperea unora dintre legăturile încrucișate ale proteinelor formate prin fixare pentru a descoperi situsurile antigenice ascunse. Acest lucru se poate realiza prin încălzire pentru diferite perioade de timp (heat induced epitope retrieval sau HIER) sau prin utilizarea digestiei enzimatice (proteolytic induced epitope retrieval sau PIER).

Una dintre principalele dificultăți cu colorarea IHC este depășirea fondului specific sau nespecific. Optimizarea metodelor și timpilor de fixare, pretratarea cu agenți de blocare, incubarea anticorpilor cu un nivel ridicat de sare și optimizarea tampoanelor de spălare post-anticorp și a timpilor de spălare sunt toate importante pentru obținerea unei imunocolorații de înaltă calitate. În plus, prezența controalelor pozitive și negative pentru colorare sunt esențiale pentru determinarea specificității.

Citometrie în fluxEdit

Un citometru în flux poate fi utilizat pentru analiza directă a celulelor care exprimă una sau mai multe proteine specifice. Celulele sunt imunocolorate în soluție folosind metode similare celor utilizate pentru imunofluorescență și apoi sunt analizate prin citometrie în flux.

Citometria în flux are mai multe avantaje față de IHC, inclusiv: capacitatea de a defini populații de celule distincte prin mărimea și granularitatea lor; capacitatea de a elimina celulele moarte; sensibilitate îmbunătățită; și analiza multicoloră pentru a măsura mai mulți antigeni simultan. Cu toate acestea, citometria în flux poate fi mai puțin eficientă în detectarea populațiilor de celule extrem de rare și există o pierdere a relațiilor arhitecturale în absența unei secțiuni de țesut. Citometria în flux are, de asemenea, un cost de capital ridicat asociat cu achiziționarea unui citometru în flux.

Western blottingEdit

Western blotting-ul permite detectarea proteinelor specifice din extractele realizate din celule sau țesuturi, înainte sau după orice etapă de purificare. Proteinele sunt, în general, separate în funcție de dimensiune cu ajutorul electroforezei pe gel, înainte de a fi transferate pe o membrană sintetică prin metode de blotting uscat, semiuscat sau umed. Membrana poate fi apoi cercetată cu ajutorul anticorpilor prin metode similare imunohistochimiei, dar fără a fi nevoie de fixare. Detecția se realizează de obicei folosind anticorpi legați de peroxidază pentru a cataliza o reacție chemiluminescentă.

Western blotting este o metodă de biologie moleculară de rutină care poate fi folosită pentru a compara semicantitativ nivelurile de proteine între extracte. Separarea dimensională înainte de blotting permite măsurarea greutății moleculare a proteinei în comparație cu markerii de greutate moleculară cunoscuți.

Enzyme-linked immunosorbent assayEdit

Dosarul imunoenzimatic sau ELISA este o metodă de diagnostic pentru determinarea cantitativă sau semicantitativă a concentrațiilor de proteine din plasma sanguină, ser sau extracte de celule/țesuturi într-un format de placă cu mai multe godeuri (de obicei 96 de godeuri pe placă). În linii mari, proteinele în soluție sunt adsorbite pe plăcile ELISA. Anticorpii specifici pentru proteina de interes sunt utilizați pentru a sonda placa. Fundalul este redus la minimum prin optimizarea metodelor de blocare și spălare (ca și în cazul IHC), iar specificitatea este asigurată prin prezența unor controale pozitive și negative. Metodele de detecție sunt, de obicei, bazate pe colorimetrie sau chemiluminescență.

Microscopie imunoelectronicăEdit

Microscopia electronică sau EM poate fi utilizată pentru a studia microarhitectura detaliată a țesuturilor sau a celulelor. Imuno-EM permite detectarea proteinelor specifice în secțiuni ultrasubțiri de țesut. Anticorpii marcați cu particule de metale grele (de exemplu, aur) pot fi vizualizați direct cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie. Deși puternică în detectarea localizării subcelulare a unei proteine, imuno-EM poate fi dificilă din punct de vedere tehnic, costisitoare și necesită o optimizare riguroasă a metodelor de fixare și prelucrare a țesuturilor. Biotinilarea proteinelor in vivo a fost propusă pentru a atenua problemele cauzate de incompatibilitatea frecventă a colorării anticorpilor cu protocoalele de fixare care conservă mai bine morfologia celulară.

.