Clostridium botulinum – Botulism (Forme clinice). Teste pentru diagnosticul botulismului. Depistarea toxinei la pacienți, alimente, furaje, nămoluri sau sedimente acvatice; păsări de apă, alte probe. Teste recomandate: detecția toxinei, cultura de C. botulinum, toxina botulinică tipizată; diagnostic molecular (PCR).

Caracteristicile Clostridium botulinum și ale toxinei botulinice/s

Clostridium botulinum este un bacil grampozitiv anaerob strict, genul Clostridium, familia Clostridiaceae, sporulat, care produce o toxină neurotoxică. Această bacterie se găsește de obicei în sol și în apa dulce netratată și în sedimente (oceane, lacuri), cu o distribuție mondială. În anumite circumstanțe, acest organism poate contamina alimentele și se poate dezvolta în ele pentru a-și produce toxina/le toxine. Botulismul, o formă gravă de intoxicație alimentară, rezultă în urma ingerării de alimente care conțin toxina. Deși această boală este rară, rata lor de mortalitate este ridicată. Atunci când s-a determinat tipul de toxină printre cele 1036 de cazuri depistate în SUA între 1899 și 1990, 384 au fost pentru toxina A, 106 din cauza toxinei B, 105 din cauza toxinei E și 3 din cauza toxinei F. Uneori pot fi cazuri datorate la două toxine, de exemplu A și B.

Toate formele de botulism uman sau animal, sunt cauzate de absorbția toxinei botulinice formate în timpul înmulțirii bacteriei Clostridium botulinum. Toxina are o toxicitate (neurotoxicitate) foarte mare, astfel că își exercită acțiunea la niveluri extrem de scăzute, este termolabilă, în timp ce sporii bacteriei sunt rezistenți la căldură și supraviețuiesc în alimente încălzite la peste 100ºC, cum ar fi conservele supuse unui tratament termic. În plus, unele tulpini de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii și C. argentinense pot produce neurotoxine botulinice.

Există șapte tipuri de toxine (A – G) diferențiabile prin teste de neutralizare, utile pentru clinică și epidemiologie. Tipurile A, B, E și F sunt principalele cauze ale botulismului uman, în timp ce tipurile C și D sunt întâlnite în cazurile de botulism animal, cele mai afectate fiind păsările sălbatice și de curte, bovinele, caii și unele specii de pești. Tipurile A și B sunt cele mai frecvente la bărbați și sunt legate în principal de contaminarea conservelor de legume preparate în casă, dar în Europa aceste tipuri au fost găsite și în legătură cu produsele din carne. Tipul E (pește) se găsește în mediile acvatice și se corelează cu cazurile de botulism E privind peștele sau crustaceele contaminate și este în creștere. Tipul F este excepțional. Tipul C este subdivizat în C1 (neurotoxină) și C2 (nu este neurotoxină, afectează permeabilitatea vasculară și este enterotoxigen). Tipul G este produs de C. argentiniense (izolat din solul din Argentina, din serul pacienților decedați, deși nu este clară implicarea).

Toxinele sunt sintetizate în timpul creșterii bacteriei ca o proteină inactivă (150 kDa), care este eliberată din bacterie în timpul lizei. Pentru a activa toxina formată trebuie să se degradeze în două lanțuri polipeptidice (50 și 100 kDa).

C. botulinum, se poate diferenția în grupuri în funcție de caracteristicile lor de cultură, biochimice și fiziologice. Toate culturile de tip A și o parte din cele de tip B și F sunt proteolitice. Culturile de toxine de C. botulinum produse de C și D nu sunt proteolitice, atunci când sunt cultivate într-un mediu cu albuș de ou coagulat sau carne. Toate tipurile E și unele din tipurile B și F sunt neproteolitice, dar au caracteristici ale metabolismului glucidic care diferă de grupurile neproteolitice de tip C și D. Tulpinile de tip G nu au A fost studiată suficient de detaliat pentru o caracterizare eficientă și satisfăcătoare.

Temperatura optimă pentru creștere și producerea de toxine este de aproximativ 35ºC pentru tulpinile proteolitice; pentru tulpinile neproteolitice este de 26-28ºC. Tulpinile neproteolitice de tip B, E și F pot produce toxină la temperaturi de refrigerare (3-4ºC). Toxinele tulpinilor neproteolitice nu prezintă toxicitate maximă până când toxina nu este activată cu tripsină. Toxinele tulpinilor proteolitice sunt în general produse în forma sa activată.

Formele clinice ale botulismului

Există patru forme clinice de botulism uman:

• Intoxicație alimentară (botulism de origine alimentară), datorată ingestiei de alimente contaminate cu Clostridium botulinum în care se formează toxina.

• Botulismul de plagă, produs prin infectarea plăgii cu Clostridium botulinum și dezvoltarea toxinei in vivo după cultivarea bacteriei în plagă.

• Botulismul infantil, produs prin producerea toxinei în tractul digestiv al copiilor mici colonizați cu Clostridium botulinum (cea mai frecventă cauză se datorează ingestiei de miere sau sirop de porumb contaminat), urmată de absorbția toxinei. Acești pacienți pot avea anticorpi împotriva toxinei.

• Botulismul intestinal la adulți, cauzat de colonizarea digestivă cu Clostridium botulinum la vârstnici, urmată de absorbția toxinei. Acești pacienți pot avea anticorpi împotriva toxinei.

În oricare dintre formele clinice de botulism uman, și la fel în botulismul animal, toxina pătrunde în sânge din tractul gastrointestinal când este ingerată preformată cu un aliment, sau când este produsă de bacteria care colonizează tractul digestiv (copii mici sau adulți), sau în cazuri excepționale copii dintr-o rană infectată cu bacteria. Există unele alimente care sunt mai susceptibile decât altele să conțină toxină botulinică. Alimentele cu un pH mai mic de 4,5 sunt mai dificil de a fi cauza botulismului, deoarece la acest pH C. botulinum nu se poate înmulți și produce toxina (este cazul sucurilor de fructe, al alimentelor marinate în oțet etc.). În schimb, alimentele cu pH egal sau mai mare de 4,5 pot provoca botulism, deoarece în ele este posibilă multiplicarea și producerea de toxină (este cazul cărnii, peștelui, legumelor, mâncărurilor preparate etc.), pe toate acele alimente expuse fără oxigen, ca în cazul alimentelor conservate sau ambalate în vid, și care au un pH mai mare de 4,6. Exemple sunt alimentele periculoase: șunca conservată, afumată, conservele de pește sau de legume (supuse unui tratament termic insuficient pentru a distruge sporii) etc. Conservele contaminate cu C. botulinum sunt de obicei curbate, deși acest lucru nu se întâmplă în cazul tipului E.

Toxina absorbită se leagă ireversibil de joncțiunile neuromusculare ale neuronilor motori, împiedicând eliberarea de acetilcolină și provocând paralizie flască sau slăbiciune musculară.

Clinic se caracterizează prin paralizie flaccidă acută, care debutează de obicei cu implicarea bilaterală a nervilor cranieni, afectând mușchii feței, capului și faringelui, iar apoi coboară simetric pentru a afecta mușchii toracici și membrele. Moartea, atunci când apare, se datorează insuficienței respiratorii prin paralizia limbii și a mușchilor faringieni care oclude căile respiratorii superioare, sau prin paralizia diafragmei și a mușchilor intercostali. Din acest motiv, pacienții trebuie să primească antitoxină botulinică și terapie intensivă respiratorie necesară.

Teste de diagnostic pentru botulism

Detecția toxinei botulinice în probe sau în alimente fără cultură (vezi proba recomandată în secțiunea de testare “Test oferit de IVAMI și probe necesare”).

Se recomandă la un pacient cu dovezi clinice de botulism.

Detecția toxinei botulinice poate fi efectuată într-un lichid, cum ar fi serul obținut din sânge. De asemenea, poate fi detectată din resturile de alimente consumate care au provocat un caz sau un focar de botulism. Pentru a efectua testul cu ajutorul resturilor de alimente, este necesar să se obțină un extract filtrat din acestea. În cazurile de botulism infantil sau botulism intestinal poate fi detectată prezența toxinei în fecalele copiilor sau pacienților, dar considerați mai recomandabilă efectuarea unei culturi preliminare de fecale (a se vedea mai jos ). Depistarea toxinei botulismului în oricare dintre cazuri se realizează prin inocularea la microunde care dezvoltă simptome paralitice, urmate de deces, dacă sunt inoculate cu toxină botulinică. Pentru a confirma că șoarecii au murit din cauza toxinei botulinice inoculate, este necesar un test de neutralizare, care confirmă că acolo a fost prezentă toxina botulinică și identifică tipul de toxină botulinică prezentă. Acest test de neutralizare se realizează confruntând produsul inoculat (ser de persoană sau de animal, extract din alimentele ingerate, …) cu antiseruri specifice fiecărui tip de toxină.

Înainte de etapa testului de neutralizare este necesar să se calculeze doza minimă letală (MLD). Astfel se calculează diluția maximă (cea mai mare) care provoacă moartea animalelor infectate, iar volumul inoculat a provocat moartea animalelor conține o doză minimă letală (LMD).

Pentru a identifica tipul de toxină, odată cunoscută “doza minimă letală”, aceasta se confruntă cu diferite antiseruri antitoxină de tip botulinum. Aceste amestecuri vor fi inoculate în volum egal la șoarecii experimentali, iar cei care supraviețuiesc, au fost inoculați cu amestecul de “doză minimă letală” plus antiserul de un tip care a fost capabil să neutralizeze.

Detecția toxinei în probe/produse după precultivare (a se vedea Proba recomandată după în testul oferit de IVAMI și probele necesare).

Când bacteria Clostridium botulinum, care produce toxina, poate fi găsită în probă se recomandă cultivarea prealabilă, pentru a investiga toxina după ce s-a cultivat proba. Acesta este cazul fecalelor unui pacient cu botulism infantil sau botulism intestinal, al resturilor de alimente consumate în care a proliferat bacteria (de exemplu, conserve de conserve), al unui aliment suspectat că ar putea conține bacteria (de exemplu, o conservă umflată), al unui aliment aflat sub control pentru a exclude prezența acestei bacterii (de ex, cârnați, jamboane, conserve), sau alte probe, cum ar fi nămoluri de apă dulce sau sedimente marine acvatice etc., din zonele în care s-a observat mortalitate la păsările de apă.

În timpul cultivării în laborator, în medii de cultură adecvate, toxina este produsă dacă există o bacterie și obținerea unui filtrat de cultură poate fi utilă pentru a investiga prezența acesteia, inoculând filtratul la șoareci. Dacă șoarecii inoculați sunt afectați, indicați prezența probabilă a Clostridium botulinum în proba o creștere în cultură. Cu toate acestea, este posibil ca șoarecii să fi murit din altă cauză, așa că este necesar, înainte de emiterea raportului, trebuie să se verifice dacă aceștia au murit cu adevărat pentru că au fost inoculați cu toxina botulinică.

Pentru a confirma prezența toxinei botulinice în cultură se pot efectua teste de neutralizare folosind antiseruri specifice pentru fiecare tip de toxină botulinică (test de neutralizare), sau detectarea prezenței genelor Clostridium botulinum și a tipului său în mediul de cultură (detecție moleculară prin PCR).

Testul de neutralizare se efectuează față de proba inoculată (filtrat de cultură) la antiseruri specifice pentru fiecare tip de toxină.

Primarul etapei de testare a neutralizării este necesar să se calculeze doza letală minimă (MLD). Astfel, se calculează diluția maximă (cea mai mare) care provoacă moartea animalelor inoculate, iar volumul inoculat care a provocat moartea animalelor conține o doză minimă letală.

Pentru a identifica tipul de toxină, odată cunoscută “doza minimă letală”, se realizează confruntarea dozei minime letale cu diferite tipuri de seruri anti-botulinice. Aceste amestecuri vor fi inoculate în volum egal la șoarecii experimentali, iar cei care supraviețuiesc, au fost inoculați cu amestecul de “doză letală minimă” plus antiserul unui tip care a fost capabil să neutralizeze.

Dezvăluirea moleculară prin PCR evită timpul necesar pentru calculul dozei letale minime (MLD) și testul de neutralizare.

Detecția anticorpilor anti-toxină botulinică (a se vedea proba recomandată după în secțiunea Test oferit de IVAMI și probe necesare)

• Pacienții tratați cu toxină botulinică diluată, cum ar fi cei care primesc botox pentru tratamente estetice sau medicale (de ex. gr. dureri datorate nevralgiei faciale de trigemen), pentru a detecta prezența anticorpilor care împiedică acțiunea acesteia.

• Pacienți cu suspiciune de botulism infantil sau botulism la adult la care nu s-a putut găsi bacteria Clostridium botulinum toxin în fecale sau în ser.

• Persoane vaccinate care sunt interesate să verifice starea de protecție.

Toxina botulinică Clostridium botulinum, la diluții foarte mari, a fost utilizată prin administrare locală pentru tratarea proceselor spastice. Aceste procese s-au dovedit a fi un remediu util. Aceste procese sunt de obicei spastice cronice necesitând astfel ca toxina să fie administrată permanent. Prin urmare, pot apărea rezistențe în timpul tratamentului din cauza imunizării progresive a pacientului pe parcursul tratamentului, caz în care efectul ar fi limitat. Pentru a detecta această imunizare este necesară măsurarea precisă și sensibilă a existenței anticorpilor împotriva toxinei botulinice A și/sau B.

Metoda de referință acceptată pentru detectarea și cuantificarea anticorpilor împotriva toxinei botulinice este testul de neutralizare la șoareci (Mouse Neutralization Assay), în care o diluție de toxină botulinică, cuantificată prin doza letală 50% pentru șoarece (DL50), se amestecă cu diferite diluții de bază 2 sau de bază 4 de ser/plasmă și, după incubare, fiecare se inoculează intraperitoneal la grupuri de șoareci. Cea mai mare diluție a serului de testare care reduce toxicitatea corespunde titrului de anticorpi împotriva toxinei botulinice corespunzătoare. Această diluție, comparată cu un standard internațional, permite obținerea de rezultate în unități internaționale (UI/mL) (1 UI este definită ca fiind cantitatea de anticorpi care neutralizează 10.000 LD50 de toxine A sau B, sau 1000 LD50 de tip E). Cantitatea de toxină utilizată în teste este una care este neutralizată de 0,02; 0,005 și 0,0125 UI/mL de antitoxină pentru tipurile A, B și, respectiv, E (Hatheway et al. 1984). Serurile care protejează șoarecii cu titru de 1: 4 sunt raportate ca <0,08 UI/mL pentru tipul A, sau <0,02 UI/mL pentru tipul B. Testul este laborios, costisitor și de lungă durată de efectuare, astfel că s-au căutat alternative enmzimoinmunoanaliză bazate pe metode (ELISA) folosind microplăci acoperite cu toxină botulinică. Cu toate acestea, valorile obținute prin ELISA uneori nu se corelează pe deplin cu testul de neutralizare la șoareci.

Înainte de etapa testului de neutralizare este necesar să se calculeze doza minimă letală (DLM) de toxină. Calculul dozei letale minime se realizează prin diluții de bază 10 ale filtratului de cultură, diluarea a jumătate cu soluție salină fiziologică pentru a obține aceeași diluție ca și toxina amestecată cu ser sau plasmă de la pacient și inocularea fiecărui amestec de diluție la șoareci de laborator. Astfel, se calculează diluția maximă (cea mai mare) care provoacă moartea animalelor infectate. Volumul inoculat care a provocat moartea animalelor conține o doză minimă letală (MLD).

După ce se cunoaște doza letală minimă, se calculează doza minimă neletală (dmnm) corespunzătoare cantității minime de toxină în prezența unei cantități constante de antitoxină, care nu ucide șoarecii inoculați. Această cantitate de toxină este neutralizată de unitățile corespunzătoare de antiotoxină anti-A sau antitoxină anti-B. Doza minimă neletală se numește astfel deoarece este cantitatea minimă de toxină care nu provoacă moartea șoarecilor în prezența antitoxinei .

Testele oferite de IVAMI și probele necesare:

• Dezvăluirea toxinei botulinice în cazuri umane sau focare de botulism de origine alimentară:

• • Serul pacientului (cel puțin 5 ml) cel mai recent obținut pentru inocularea în șoareci și tipizarea toxinei, dacă șoarecii au fost afectați.

• • În cazurile de botulism infantil sau botulism intestinal, toxina botulinică poate fi detectată în materiile fecale ale copiilor/pacienților, dar este mai indicat să se efectueze o cultură preliminară a materiilor fecale.

• Detecția toxinei și/sau a Clostridium botulinum în alimentele ingerate, suspecte de a provoca botulism sau în alimentele supuse controlului

• Eșantion din alimentele suspecte sau controlate (se recomandă cel puțin aproximativ 100 de grame) pentru a pregăti o probă destinată inoculării la șoareci și detectarea prezenței toxinei preformate în alimente, precum și pentru efectuarea unei culturi în vederea obținerii filtratului pentru inocularea șoarecilor și pentru a determina dacă în eșantion există o bacterie producătoare de toxină; În cazul în care aveți doar resturi de alimente, se recomandă să trimiteți întreaga cantitate disponibilă.

• Detecția Clostridium botulinum în cazuri de botulism infantil sau botulism intestinal

• • Fecale în cazuri de botulism infantil sau botulism intestinal datorate colonizării intestinale (10 g), pentru cultură și detectarea toxinei în filtratul de cultură prin inoculare la șoareci.

• Detecția Clostridium botulinum în cazurile de botulism de plagă

• • Exsudat de plagă în cazurile de suspiciune de botulism de plagă, pentru cultura și detectarea toxinei în filtratul de cultură prin inoculare la șoareci. Dacă proba este transportată aerob, este posibil ca Clostridium botulinum să fi fost inactivat, ar fi mai convenabil să se efectueze un test molecular pentru detectarea prezenței genelor Clostridium botulinum și, dacă este pozitiv, să se identifice tipul de toxină botulinică prin detectarea genelor corespunzătoare fiecărui tip de toxină.

• Detecția Clostridium botulinum în probe de nămol de apă dulce sau sedimente marine acvatice și alte produse neincluse în secțiunile anterioare

• • Probe de 100 g aproximativ pentru efectuarea unei culturi pentru creșterea Clostridium botulinum și obținerea unui filtrat de cultură pentru inocularea șoarecilor.

• Detecția anticorpilor antitoxină botulinică în ser sau plasmă

• • Ser sau plasmă (aproximativ 10 ml), pentru a testa anticorpii de neutralizare în ser sau plasmă împotriva diferitelor toxine disponibile în laborator. Acest test este de interes pentru a determina prezența anticorpilor specifici la persoanele tratate cu toxină botulinică, la pacienții cu suspiciune de botulism infantil, la adulții la care nu a fost posibilă găsirea bacteriei în fecale sau la persoanele vaccinate pentru a verifica starea de protecție. În cazul persoanelor tratate cu toxină botulinică Trebuie să se indice tipul de toxină administrată pacientului.

Timp de raportare a rezultatelor (TAT)

• Nu putem da timpi exacți. În cazul în care se testează doar pentru detectarea toxinei prin inoculare la șoareci și rezultatul este negativ, raportarea rezultatelor ar fi de maximum o săptămână. Dacă testarea include cultivarea probei, iar apoi detectarea toxinei realizate prin inocularea unui filtrat de cultură de șoareci, timpul ar fi de două săptămâni. Dacă oricare dintre aceste teste inocularea șoarecilor, extractul dintr-o probă sau filtrat de cultură, au fost pozitive, trebuie efectuat testul de neutralizare la șoareci pentru a corobora că este toxina botulinică și a identifica tipul acesteia prin teste de neutralizare, timpul de finalizare este de 15 zile.

• Testele PCR în timp real raportul sunt în 3 sau 4 zile.

Formular cu caracteristicile produsului și testul/testele alese

• Dacă se solicită efectuarea de teste cu produsul trebuie să se prezinte o scrisoare în care să se precizeze caracteristicile produsului și testele alese pentru a fi efectuate cu proba trimisă.

Volumul probei

• Vezi în fiecare caz în parte, în funcție de tipul de teste oferite de IVAMI.

Condiții de păstrare și expediere a probelor

• Se trimit în condițiile în care se găsește de obicei proba, protejată pentru transport. În cazul probelor care se pot descompune pentru că sunt contaminate cu bacterii, sau prin propria organică (produse perisabile, seruri de origine animală sau umană, fecale, nămoluri, …. …), probele trebuie depozitate și expediate congelate, sau cel puțin în condiții care să asigure răcirea în timpul transportului (cu recipientul pentru probe în interiorul unei cutii -polistiren expandat- (plută albă) cu pachete frigorifice congelate. Notă: acest organism, prin el însuși, nu prezintă risc de contaminare prin expunere biologică.

Costul testelor

Dezvăluirea toxinelor în cazuri umane / focare de botulism de origine alimentară

• • Inocularea la șoareci cu ser de la pacient sau extract din alimente ingerate ………………………………. …………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………Consultați [email protected]

• • Dacă este pozitiv, test de confirmare pentru neutralizare și identificarea tipului de toxină …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultați [email protected] .

• Detecția toxinei și/sau a Clostridium botulinum în alimentele ingerate, suspectate de a provoca botulism sau în alimentele supuse controlului

• Detecția Clostridium botulinum în cazurile de botulism infantil sau botulism intestinal

• • Opțional: Test de inoculare la șoareci cu ser sau extract din alimente ingerate ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consultați [email protected]
  • Recomandat. Test de cultură, urmat de inocularea șoarecilor cu filtrat de cultură ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultați [email protected]
  • Dacă este pozitiv, test de confirmare pentru neutralizare și identificarea tipului de toxină ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]

• Detectarea Clostridium botulinum în cazurile de botulism de plagă

• • Test de cultură, urmat de inocularea șoarecilor cu filtrat de cultură ……………………. Consultați [email protected]
  • În cazul în care este pozitiv, test de confirmare pentru neutralizare și identificarea tipului de toxină …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultați [email protected]

• Detecția Clostridium botulinum în probe de nămol/apă dulce sau sedimente marine, precum și în alte produse neincluse în secțiunile anterioare

• • Test de cultură, urmat de inocularea șoarecilor cu filtrat de cultură ……………………. Consultați [email protected]
  • Dacă este pozitiv, test de confirmare pentru neutralizare și identificarea tipului de toxină ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consultați [email protected]

• Detecția de toxină anti-botulinică în ser sau plasmă (se referă la un tip de anticorp, deci trebuie să se indice tipul de toxină administrat individului) ……………………………………………….. Consult [email protected]