Discuție

Microbiota umană cuprinde mai mult de o mie de specii bacteriene distincte și joacă un rol major în sănătatea umană prin promovarea aprovizionării cu nutrienți, prevenirea colonizării cu agenți patogeni și modelarea și menținerea imunității normale a mucoaselor. Bacteriile intestinale comensale au fost recent apreciate ca având o adevărată relație simbiotică cu gazda ; în cadrul acestui mare grup de bacterii, s-a afirmat că suplimentele probiotice care conțin LAB (de exemplu, lactobacili și bifidobacterii) au o varietate de efecte benefice asupra sănătății umane, cum ar fi prevenirea diareei și a bolilor inflamatorii intestinale sau profilaxia infecțiilor urogenitale . Cu toate acestea, cunoștințele noastre despre rolurile biochimice pe care anumite specii și tulpini le joacă în sănătatea și bolile umane sunt extrem de limitate. În acest studiu, am urmărit să avansăm înțelegerea căilor de reducere a nitraților în anumite specii bacteriene comune selectate care colonizează intestinul uman, utilizând condiții in vitro compatibile cu dietele bogate în nitrați și nivelurile de oxigen găsite pe suprafețele mucoasei tractului gastrointestinal. Principalele constatări ale investigației noastre indică faptul că: 1) E.coli, un anaerob facultativ, transformă nitratul în nitrit și, ulterior, în amoniac, care se acumulează progresiv în mediile de cultură; 2) L.plantarum, o bacterie fermentativă, cultivată în prezența hemei exogene și a vitaminei K2, realizează procese similare; 3) enzimele E.coli generează o cantitate semnificativă de NO din nitriți numai în condiții anaerobe; 4) toate culturile LAB examinate generează cantități mari de acid lactic, provocând o acidificare suficientă a mediilor de cultură pentru a determina disproporționarea nitriților în NO.

Majoritatea eucariotelor își obțin energia în principal prin fosforilare oxidativă și trebuie să respire O2 pentru formarea de ATP, însă multe bacterii enterice, inclusiv tulpinile E.coli K12, pot utiliza NO3- ca acceptor alternativ de electroni atunci când O2 este limitativ și nitratul este abundent . E.coli reprezintă membrul model al Enterobacteriaceae și, deși această familie constituie doar o mică parte din microbiota intestinală, este deosebit de importantă, deoarece anumite tulpini pot provoca boli. De asemenea, s-a demonstrat recent că nitratul generat ca un produs secundar al inflamației gazdei poate fi utilizat de E.coli în timpul respirației pentru a conferi un beneficiu de creștere și pentru a concura microbii care locuiesc în colon și care se bazează doar pe fermentație . L. plantarum este considerat un probiotic sigur și se găsește în mod obișnuit în tractul intestinal al mamiferelor, precum și în saliva umană, unde se știe că nitrații se acumulează până la niveluri milimolare din cauza ciclului entero-salivar al nitraților, care reprezintă aproximativ 25 % din totalul nitraților circulanți . Această bacterie prezintă calea heterofermentativă facultativă tipică a familiei LAB, dar, unică pentru această specie, în genomul L. plantarum WCFS1 au fost identificate recent gene care codifică un sistem putativ de nitrat-reductază (narGHJI), ceea ce sugerează că aceasta este capabilă să utilizeze nitratul ca acceptor de electroni . Într-adevăr, o analiză genetică recent publicată a L.plantarum a evidențiat capacitatea sa metabolică extrem de diversă și versatilă.

În experimentele noastre, s-a detectat o activitate semnificativă de nitrat reductază atât la E.coli, cât și la L. plantarum, pe măsură ce tensiunea de oxigen scade de la nivelul atmosferic spre zero. Dimpotrivă, B.longum infantis, un anaerob tolerant la microaeroterapie, de origine din tractul gastrointestinal al sugarilor, nu a arătat nicio capacitate de reducere a nitraților, chiar și la concentrații ridicate. Bifidobacteriile reprezintă până la 90 % din bacteriile din tractul gastrointestinal al sugarului, iar rezultatele noastre sunt în concordanță cu observația conform căreia laptele matern uman, care prezintă niveluri deosebit de ridicate de nitriți , oferă o sursă alimentară de nitriți înainte de stabilirea microbiotei linguale și intestinale capabile să reducă nitrații, care se găsesc în mod normal în flora adultă.

În Fig. 1 am arătat că culturile de E.coli care conțin 5 mM NO3- au un avantaj competitiv de creștere față de culturile fără adaos de nitrat și apoi am determinat efectul gradienților de oxigen și nitrat asupra producției de nitriți și amoniac. Rezultatele noastre indică faptul că aproximativ 2,5 mM NO3- la 4% sau la o concentrație mai mică de O2 este suficient pentru a induce expresia enzimelor nitrat reductazei și că, după 24 de ore, o cantitate considerabilă de nitriți s-a acumulat atât în interiorul celulelor E.coli, cât și în mediul de cultură. O analiză moleculară detaliată a reglării activităților enzimatice bacteriene depășește sfera de aplicare a acestui studiu, însă este bine cunoscut faptul că tulpinile de E.coli K12 exprimă trei nitrat reductaze care conțin molibden și că tungstenul poate dezactiva aceste enzime prin înlocuirea atomului de molibden din situsul activ. Am constatat că adăugarea a 300 μM de oxid de tungsten la culturile cultivate ca în experimentele raportate în figura 1 a eliminat aproape complet formarea de nitriți (datele nu sunt prezentate). Astfel, credem că reductazele de nitrat dependente de molibden sunt responsabile de etapa crucială în formarea nitriților. De asemenea, este important de remarcat faptul că E.coli, precum și multe alte specii de bacterii, sunt sensibile la toxicitatea nitriților din cauza formării de complecși metal-nitrozil și că acestea minimizează această toxicitate prin inducerea coordonată a unui transportor membranar de nitriți și a altor enzime care mediază reducerea nitriților. O descriere completă a reglementării și exprimării genelor enzimelor nitrat și nitrit reductazei din E.coli și a operonilor poate fi găsită în publicațiile excelente ale lui Stewart și Cole .

Cale de reducere a oxizilor de azot în intestinul uman

Prezența nitraților și nitriților în tractul GI inferior depinde de numeroase aspecte, inclusiv de tipurile de bacterii care colonizează intestinul și de echilibrul complicat dintre alimentație și căile metabolice ale oxizilor de azot. Cu toate acestea, producția endogenă de nitrat din oxidarea NO (în principal prin reacția cu oxihemoglobina) a fost recunoscută de mult timp ca fiind cu un ordin de mărime mai mare decât aportul alimentar, după cum s-a demonstrat la sfârșitul anilor 1970 și, mai recent, în studiile care utilizează șoareci cu deficit de eNOS . În reprezentarea schematică din Fig. 5 am rezumat legătura dintre denitrificarea respiratorie bacteriană, reducerea oxizilor de azot la amoniac, calea L-argininei/NO sintetazei endogene și reducerea neenzimatică a nitriților la NO. În procesul de denitrificare (caseta roșie), nitratul este redus la azot gazos (N2) într-un proces în patru etape în care nitriții, NO și protoxidul de azot sunt acceptori de electroni în reacții generatoare de energie. Recent, s-a dovedit existența unei căi complete de denitrificare, care duce la producerea de N2, în placa dentară umană și, deși se consideră în continuare că aceasta are o importanță minoră la om, speculăm că ar putea avea un rol important în condiții de tensiune foarte scăzută a oxigenului în prezența nitraților, iar formarea de N2 nu poate fi exclusă în intestinul uman. Denitrificarea și reducerea disimilatorie a nitraților la amoniac (DNRA, caseta albastră) au în comun prima etapă de reducere a nitraților la nitriți, iar mai multe clase de nitrat reductaze au fost asociate cu această reacție. În DNRA, a doua etapă este reducerea directă de la nitriți la amoniac cu șase electroni, care nu furnizează energie, dar este un proces de detoxifiere destul de comun în bacteriile anaerobe facultative. S-a sugerat că DNRA reprezintă principala cale de metabolizare a nitraților în rumenul mamiferelor . Acest studiu a identificat amoniacul ca produs al reducerii nitraților în bacteriile E.coli și Lactobacilli cultivate în prezența nitraților mM la 4% oxigen sau la niveluri mai mici.

Expand

Denitrificarea respiratorie poate genera, de asemenea, cantități mici, dar relevante de NO ca produs intermediar și a fost implicată în producția bacteriană de NO în intestin . Alte căi posibile de producere a NO sunt conversia acidă a nitriților (caseta verde) și oxidarea L-argininei de către enzimele NOS (cercul maro). În Fig. 4C am examinat dependența de protoni a disproporționării neenzimatice a nitriților și am arătat că aceasta devine relevantă numai atunci când pH-ul intracelular sau al fluidelor corporale este mai mic de 5,5. Rezultatele noastre au exclus, de asemenea, prezența enzimelor NOS active în E.coli și L.plantarum, cu toate acestea, se știe că celulele epiteliale intestinale produc NO prin exprimarea atât a izoformelor NOS endoteliale, cât și a izoformelor NOS inductibile. În mod interesant, producția de NO în intestin ar putea fi declanșată și de procesele enzimatice ale peroxidazelor, care sunt abundente pe celulele mucoasei intestinale și despre care s-a demonstrat că folosesc nitritul ca substrat pentru a produce NO ca parte a acțiunii lor antibacteriene.

Credeam că toate aceste căi diferite de reducere a nitraților pot coexista și avea loc simultan, însă este probabil ca doar un singur metabolit să predomine în funcție de condițiile fiziologice specifice.

Semnificația fiziologică a formării NO prin reducerea bacteriană a nitraților

Nitrații și nitriții alimentari sunt încă prezentați ca posibile substanțe toxice în multe studii, în ciuda dovezilor tot mai numeroase că producția de NO din acești ioni are implicații benefice importante pentru funcțiile cardiovasculare, imunitare și gastrointestinale . În intestin, NO îndeplinește mai multe funcții fiziologice, cum ar fi reglarea fluxului sanguin al mucoasei, a mobilității intestinale și a grosimii mucusului. Supraproducția cronică de NO a fost, de asemenea, asociată cu boala inflamatorie intestinală și este posibil să inhibe creșterea unei mari varietăți de specii bacteriene. Studiile anterioare au lăsat neclar modul în care bacteriile intestinale produc NO, însă Sobko și colab. au arătat că, spre deosebire de șobolanii convenționali, nivelurile de NO din intestinul șobolanilor fără germeni sunt extrem de scăzute, iar atunci când sunt inoculate cu o floră bacteriană normală, producția de NO observată a crescut de 10 ori.

În experimentele noastre, concentrațiile de oxigen și protoni au determinat calea specifică de reducere a nitraților la NO. Rezultatele prezentate în Fig. 4A indică faptul că E.coli este capabilă de o activitate enzimatică a NO în condiții anaerobe cu concentrații de nitrați mai mari de 1 mM, posibil prin denitrificare sau prin intermediul enzimei citocrom c nitrit reductază periplasmatică (Nrf), așa cum au propus Corker și Poole . Cu toate acestea, această generare de NO este mult redusă la 2% oxigen și devine independentă de nitrați. Este important de menționat faptul că datele noastre sunt în concordanță cu raportul lui Sobko și colaboratorii, conform căruia E. coli a generat niveluri nesemnificative de NO în timpul incubării de 24 de ore cu 0,1 mM de nitrat . LAB a produs cantități considerabile de NO ca răspuns la acidificarea mediului datorită acumulării de acid lactic. Înlocuirea mediului de creștere cu LMRS proaspăt (pH = 6,5) a blocat aproape complet capacitatea culturilor de LAB de a converti nitriții în NO, dar nu și în cazul E.coli. Măsurătorile pH-ului din intestin variază între 5,7 și 7,5, astfel încât disproporționarea in vivo a nitriților este probabil un aspect minor și localizat al producției de NO. Invers, această cale este un fenomen bine stabilit în mediul acid al stomacului (pH de aproximativ 3).

În concluzie, sugerăm că NO generat de bacteriile intestinale în apropierea mucoasei intestinale poate fie să exercite efectele benefice notate mai sus, fie, la niveluri mai ridicate, să interfereze cu aceste funcții. Astfel, formarea bacteriană de NO în intestin poate fi privită ca un modulator al efectelor fiziologice și patologice.

Implicații fiziologice ale formării de amoniac bacterian pentru sănătate

Bacteriile colonice sunt cunoscute ca produc amoniac prin dezaminare de aminoacizi sau prin intermediul ureazei, hidroliza ureei în dioxid de carbon și amoniac, încă de la studiile seminale ale lui Vince et al. de la începutul anilor 1970 . Mai recent, Cole și colegii săi au raportat că principalul produs al reducerii nitriților în E.coli este amoniacul, doar aproximativ 1% fiind redus la NO la pH neutru. Rezultatele obținute în studiul nostru sugerează că cel puțin anumite bacterii intestinale comune reduc în principal nitriții la amoniac și nu la NO. La subiecții sănătoși, în condiții fiziologice obișnuite, cea mai mare parte a amoniacului generat în tractul gastrointestinal inferior este apoi excretată în fluidele corporale și metabolizată de hepatocitele hepatice, unde amoniacul și dioxidul de carbon sunt transformate enzimatic în carbamoil fosfat, care intră în seria de reacții numită “ciclul ureei” care duce la formarea ureei și eliminarea acesteia de către rinichi (a se vedea Fig. 5). Concentrația plasmatică normală de amoniac se situează în intervalul 10-35 μM, cu toate acestea, atunci când producția de amoniac este excesivă, amoniacul purtător de sânge portal poate ocoli ficatul ducând la hiperamoniemie . Amoniacul din sânge pătrunde liber prin bariera hemato-encefalică, iar nivelurile ridicate (>100 μM) au efecte toxice asupra sistemului nervos central, ducând la encefalopatie și, în cele din urmă, la comă. Pacienții cu ciroză hepatică dezvoltă foarte frecvent encefalopatie hepatică (HE) . În absența insuficienței hepatice, coma hiperamonemică a fost atribuită septicemiei provocate de microorganisme capabile de urează, cum ar fi Klebsiella pneumonia . Abordările terapeutice clasice pentru HE implică reducerea nivelului de amoniac sistemic prin tratament cu antibiotice (pentru a distruge bacteriile intestinale producătoare de amoniac) și administrarea de zaharuri neabsorbabile, cum ar fi lactuloza și lactitolul . În intestinul gros, lactoza este descompusă de acțiunea bacteriilor colonice, în primul rând în acid lactic și, de asemenea, în cantități mici de acid formic și acetic . Această acidificare favorizează formarea ionului de amoniu neabsorbabil din amoniac și reduce concentrația acestuia în plasmă. Nu este clar în ce măsură nitratul alimentar contribuie la concentrația de amoniac în intestin și în sânge, însă sugerăm ipoteza alternativă că acidificarea crescută a conținutului colonic datorată prezenței lactulozei favorizează conversia de către microbiotă a nitriților în NO în loc de amoniac prin mecanismul cunoscut dependent de acid.

Concluzii

De mai bine de 30 de ani, soarta biologică a nitratului exogen nu a putut fi contabilizată în compușii cu conținut de azot excretați, care reprezintă aproximativ 60% dintr-o doză de nitrat ingerată la om. Rezultatele noastre susțin ideea că nitratul este transformat în nitriți și apoi în alte biomolecule de azot redus, cum ar fi NO, amoniac, uree și, eventual, azot gazos, de către bacteriile din salivă, stomac, intestinul subțire și gros. Întrebări precum cât de mult amoniac este generat din reducerea nitrat-nitrit față de alte procese importante, cum ar fi dezaminarea și activitatea ureazelor bacteriene, necesită studii metabolice detaliate la animale și/sau oameni. Semnificația biologică a conversiei nitraților alimentari la nivelul lumenului intestinal rămâne să fie stabilită. Cu toate acestea, dietele tradiționale japoneze și mediteraneene, despre care se știe că au efecte de protecție cardiovasculară, au un aport mediu de nitrați pe persoană de 2 până la 3 ori mai mare decât dieta occidentală tipică (în Statele Unite, ceea ce corespunde la aproximativ 40-100 mg/zi de nitrați). Sunt necesare investigații suplimentare privind legătura dintre bacteriile simbiotice, metabolismul oxizilor de azot și sănătatea umană; cu toate acestea, este clar că căile biologice ale metabolismului azotului la mamifere sunt mai complexe și mai importante decât se preconiza chiar și cu câțiva ani în urmă.

.