REZULTATE ȘI DISCUȚII
O linie celulară de melanom A375 cu o MAPK activată constitutiv datorită unei mutații BRAFV600E a fost tratată cu inhibitorul MEK U0126 la o concentrație de 25 μM timp de 8 h, ceea ce a dus la suprimarea fosforilării ERK (Fig. 1 a). ARNm al factorilor solubili imunosupresori, inclusiv IL-6, IL-10 și VEGF, a scăzut semnificativ odată cu tratamentul cu U0126 (Fig. 1 b), în timp ce tratamentul cu DMSO de control nu a afectat producția de ARNm al IL-10 și VEGF și a crescut doar ușor nivelul ARNm al IL-6. O expunere de 18 ore la U0126 a suprimat, de asemenea, producția de IL-10, VEGF și IL-6 la nivel proteic, ceea ce indică faptul că ERK-urile activate pot fi responsabile de suprimarea răspunsurilor imune locale împotriva melanomului prin producerea acestor factori imunosupresori (Fig. 1 c). În plus, suprimarea fosforilării ERK și inhibarea producției de IL-6, IL-10 și VEGF au avut loc chiar și după reducerea concentrației tratamentului cu U0126 la 10 μM (nereprezentat). În timpul acestui studiu, nu au fost observate efecte citotoxice semnificative cu tratamentul cu U0126 al celulelor A375. Deși se știe că U0126 inhibă MEK5 în plus față de MEK1/2, ERK5 fosforilat, substratul MEK5, nu a fost detectat în celulele A375 (nereprezentat), ceea ce indică faptul că calea MEK1/2-ERK1/2 este responsabilă pentru efectele observate cu tratamentul cu U0126. Efectele supresive ale U0126 asupra producției de IL-10 și VEGF au fost, de asemenea, demonstrate în alte trei linii celulare de melanom cu mutația BRAFV600E, 624mel, 888mel și 928mel, fără nicio toxicitate celulară semnificativă (Fig. 1 d). Deoarece aceste linii celulare de melanom nu produc IL-6, se pare că semnalizarea MAPK activată are un rol general în producția de factori imunosupresori IL-10 și VEGF în liniile celulare de melanom BRAFV600E+.
Diminuarea producției de factori solubili imunosupresori IL-6, IL-10 și VEGF din liniile celulare de melanom cu MAPK constitutiv activ prin mutația BRAFV600E prin inhibarea semnalizării MAPK cu un inhibitor MEK, U0126. (a) Inhibarea fosforilării ERK1/2 a fost detectată prin analiza Western blot a liniei celulare de melanom A375mel cu mutația BRAFV600E înainte și la 2, 4, 6 și 8 ore după tratamentul cu inhibitorul MEK U0126 la o concentrație de 25 μM. (b) Inhibarea expresiei ARNm pentru factorii solubili imunosupresori IL-6, IL-10 și VEGF în celulele A375. ARNm pentru diverși factori solubili, inclusiv IL-6, IL-10 și VEGF, au fost măsurați prin RT-PCR cantitativ înainte și la 2, 4, 6 și 8 ore după tratamentul cu U0126. Tratamentul de control a fost efectuat cu o soluție DMSO. Nivelurile ARNm la fiecare punct de timp au fost normalizate la ARNm GAPDH și indicate ca valoare relativă față de cea de la 0 h. (c) Scăderea producției de proteine IL-6, IL-10 și VEGF din celulele A375 după un tratament de 18 h cu U0126 la o concentrație de 25 μM. Expresia a fost detectată prin ELISA cu supernatantele de cultură. Raportul dintre viabilitatea celulelor tratate cu U0126 și celulele tratate cu DMSO la recoltare a fost de 77%. Producția de citokine a fost normalizată în raport cu valoarea celulelor de control tratate cu DMSO pe baza numărului de celule. Western blot a arătat o puternică inhibiție a fosforilării ERK, dar nu și a proteinei STAT3, sau a fosforilării acesteia la Ser727 și Tyr705. (d) Scăderea producției de IL-10 și VEGF de la trei linii celulare de melanom cu mutația BRAFV600E, 624mel, 888mel și 928mel, după un tratament de 18 ore cu U0126 la o concentrație de 25 μM, care a fost detectată prin ELISA cu supernatantele de cultură. Rapoartele de viabilitate ale celulelor tratate cu U0126 și DMSO la recoltare au fost de 95 % pentru 624mel, 103 % pentru 888mel și 100 % pentru 928mel. Producția de citokine a fost normalizată față de valoarea celulelor de control tratate cu DMSO pe baza numărului de celule. Western blot a arătat o puternică inhibiție a fosforilării ERK, dar nu și a proteinei STAT3. O ușoară scădere a fosforilării Ser727 a STAT3 a fost observată în celulele 888mel și 928mel, dar nu și în celulele 624mel. Aceste rezultate sunt reprezentative pentru trei sau patru experimente independente cu rezultate similare.
Cu toate acestea, efectele nespecifice ale U0126 asupra producției de citokine prin alte căi decât cea de semnalizare MAPK nu pot fi complet excluse din aceste experimente din cauza ușoarei scăderi observate a fosforilării STAT3 la Ser727 în 888mel și 928mel (Fig. 1 d). Pentru a confirma rolul MAPK activat din cauza mutației BRAFV600E în producția de IL-10, VEGF și IL-6, ARNi specific BRAFV600E a fost transfectat în trei linii celulare de melanom, A375, 888mel și 624mel, utilizând lentivirusul care exprimă ARN în formă de ac de păr scurt (ARN scurt) specific BRAFV600E (shRNA) (11). ARNi specific BRAFV600E a inhibat semnificativ producția de IL-10, VEGF și IL-6, precum și a suprimat fosforilarea ERK (Fig. 2). Aceste rezultate confirmă faptul că inhibarea acestor factori de către U0126 (Fig. 1) este corelată cu inhibarea specifică a căii MAPK. Aceste rezultate sunt în concordanță cu lucrări recente care arată producția de IL-10 indusă de ERK1/2 în macrofagele murine (12) și producția de VEGF dependentă de BRAFV600E pentru promovarea angiogenezei (13).
Diminuarea producției de factori imunosupresori IL-6, IL-10 și VEGF de la trei linii celulare de melanom cu mutația BRAFV600E prin RNAi specific BRAFV600E. Cele trei linii celulare de melanom cu mutația BRAFV600E, A375mel, 888mel și 624mel, au fost infectate cu vectori lentivirus care codifică ARN în ac de păr scurt pentru ARNm de luciferază de licurici (GL3B; ca martor) sau ARNm BRAFV600E (BRAF#1′) la 50 sau 100 de multiplicități de infecție. La 5 sau 6 d după infecție, proteinele au fost extrase și supuse analizei Western blot. Scăderea profundă a fosforilării ERK1/2 odată cu scăderea proteinei BRAF a fost observată prin RNAi specific BRAFV600E. Nu s-a observat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește proteina STAT3 și fosforilarea STAT3 la Ser727 sau Tyr705. O ușoară scădere a fosforilării la Ser727 a fost observată în celulele 888mel și 624mel după BRAF RNAi. La 5 sau 6 d după infecția cu lentivirus, un număr egal de celule de melanom a fost distribuit la o densitate de 1-2 × 106 celule/2 ml, iar supernatantele de cultură după 18 h au fost supuse ELISA pentru IL-6, IL-10 sau VEGF. S-a observat o scădere profundă a IL-6, IL-10 și VEGF. Este prezentat un rezultat reprezentativ a două sau trei experimente independente cu rezultate similare.
Pentru că s-a stabilit că semnalizarea STAT3 activată are ca rezultat evadarea imunitară a cancerului prin producerea de diverși factori, inclusiv VEGF (8, 9), am investigat relația dintre căile MAPK și STAT3 în ceea ce privește producerea de factori imunosupresori în linia celulară de melanom A375. Producția de IL-6, IL-10 și VEGF a fost profund inhibată de RNAi care vizează fie BRAFV600E singur, fie STAT3 singur (Fig. 3 a). Nu s-a observat niciun efect aditiv sau sinergic clar prin restricționarea simultană a căilor BRAF-MAPK și STAT3 (Fig. 3 a). BRAFV600E RNAi în celulele A375 nu a diminuat activitatea de legare la ADN a STAT3 (Fig. 3 b), activitatea promotorului STAT3 (Fig. 3 c) sau fosforilarea STAT3 la Ser727 sau Tyr705 (Fig. 2), deși s-a raportat că ERK-urile sunt potențial capabile să fosforileze STAT3 la Ser727 (14). Cu toate acestea, fosforilarea STAT3 poate avea loc, de asemenea, printr-o cale independentă de ERK (15). În celulele 624mel, deși a existat o ușoară scădere a STAT3 fosforilat Ser727, activitatea de legare la ADN (Fig. 3 b) și activitatea promotorului STAT3 (Fig. 3 c) nu au fost afectate de RNAi BRAFV600E (Fig. 2). În celulele 888mel, s-a înregistrat o scădere similară a fosforilării Ser727, dar, dimpotrivă, atât activitatea de legare la ADN a STAT3 (Fig. 3 b), cât și activitatea promotorului STAT3 (Fig. 3 c) au scăzut după BRAFV600E RNAi (Fig. 2). Aceste rezultate sugerează că reducerea activității de transcripție a STAT3 nu este mecanismul principal care generează suprimarea factorului imunosupresor prin reglarea în jos a semnalizării MAPK în aceste linii celulare de melanom.
Inhibarea producției de IL-6, IL-10 și VEGF în celulele A375 prin RNAi pentru BRAFV600E singur, STAT3 singur sau ambele, fără modificări semnificative ale activității de legare la ADN și a activității de promotor a STAT3. (a) Inhibarea profundă a producției de IL-6, IL-10 și VEGF în A375 prin RNAi pentru BRAFV600E singur, STAT3 singur sau ambele. La 5 sau 6 d după infecție, un număr egal de celule a fost distribuit la o densitate de 106 celule/2 ml, iar supernatantul de cultură după 18 h a fost supus ELISA pentru IL-6, VEGF și IL-10. Scăderea BRAF și a ERK1/2 fosforilat prin ARNi specific BRAFV600E și scăderea STAT3 prin ARNi specific STAT3 au fost confirmate prin analiză Western blot. Este prezentat un rezultat reprezentativ din șase experimente independente cu rezultate similare. (b) Nicio modificare semnificativă a activității de legare la ADN a STAT3 prin inhibarea semnalizării MAPK cu BRAF RNAi în liniile celulare de melanom. Activitatea de legare la ADN a STAT3 a fost examinată prin EMSA a extractelor nucleare din liniile celulare de melanom cu tratament cu vector de control GL3B sau BRAF#1′ shRNA. Benzile specifice STAT3 indicate prin săgeți au dispărut cu sonda ADN STAT3 de tip sălbatic la rece (wt), dar nu și cu sonda ADN STAT3 mutant (mt). Doar o ușoară scădere a activității de legare la ADN a STAT3 a fost observată în celulele 888mel. (c) Testele reporterilor STAT3 în celulele A375, 624mel și 888mel. 2-4 × 105 celule cu control sau cu infecție cu vectorul BRAF#1′ shRNA au fost transfectate cu 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc și 0,4 μg pRL-SV40 cu Effectene Transfection Reagent. La 24 h după transfecție, celulele au fost recoltate și analizate pentru activitatea luciferazei firefly și renilla. Fiecare activitate a luciferazei licurici a fost normalizată cu activitatea luciferazei renilla. Barele umbrite și barele de eroare indică media și, respectiv, deviația standard a testelor în trei exemplare. Este prezentat un experiment reprezentativ din trei sau patru experimente independente. Transcripția determinată de STAT3 nu a fost modificată după BRAF RNAi în A375 și 624mel, dar a scăzut ușor în 888mel.
În continuare, au fost investigate efectele potențiale cauzate de factorii solubili induși de semnalizarea MAPK și STAT3 în supranatantul culturilor A375 asupra maturării DC-urilor. Supernatantul din celulele de melanom A375 cultivate conține factori solubili care inhibă maturarea DC derivate din monocite umane (MoDC) atunci când sunt stimulate cu liganzi ai receptorilor Toll-like, cum ar fi LPS. Adăugarea supernatanților de cultură A375 la culturile de MoDC la o concentrație finală de 10-20% a scăzut semnificativ producția de citokine inflamatorii, inclusiv IL-12 și TNF-α, în MoDC, precum și a moleculelor de suprafață celulară CD1a și CD83, dar nu și a CD80, CD86, CD40 sau HLA-DR pe MoDC. Supernatantele de la celelalte trei linii celulare de melanom au produs aceleași rezultate atunci când au fost adăugate la culturile de MoDC (nu sunt reprezentate). Activitatea supresivă a supernatantelor celulelor de melanom provine din producția de IL-6, IL-10 și VEGF, deoarece adăugarea de anticorpi specifici pentru acești factori a redus activitatea supresivă a supernatantelor culturii A375 (Fig. 4 a). Disparitățile dintre observațiile noastre și rezultatele raportate anterior cu privire la supranatantul de celule de melanom murin B16 cu un STAT3 activat care inhibă expresia MHC clasa II și CD40 pot fi explicate prin celule sau specii tumorale diferite (8).
Diminuarea activității supresive a supernatantelor de cultură de melanom A375 prin pretratarea cu RNAi pentru BRAFV600E singur, STAT3 singur sau ambele asupra producției de IL-12 și TNF-α induse de LPS de către DCs. (a) Neutralizarea IL-6, IL-10 sau VEGF în supernatantele de cultură ale celulelor de melanom A375 a restabilit inhibarea producției de IL-12 de către DC umane stimulate de LPS. MoDC umane au fost cultivate cu supernatantele A375 în prezența sau absența anticorpului monoclonal pentru IL-6, IL-10, VEGF sau a unui anticorp de control izotip la 1 μg/ml. Producția de IL-12 în supranaturile de cultură a fost determinată prin ELISA la 24 h după stimularea cu LPS la 100 ng/ml. (b) Monocitele CD14+ au fost izolate din PBMC cu ajutorul MACS și au fost cultivate în medii care conțin RPMI 1640, 10% (vol/vol) FBS, 100 ng/ml GM-CSF și 50 ng/ml IL-4 cu sau fără 20% (vol/vol) din supernatantul de cultură al celulelor A375mel preparate în Fig. 3. (a) Jumătate din mediile, citokinele și supernatantul de cultură au fost schimbate la fiecare 2 d. În ziua 5 de cultură, s-a adăugat LPS la 100 ng/ml. După 15 h, supernatantele de cultură au fost colectate și supuse ELISA pentru IL-12 și TNF-α.
Activitatea supresivă a supernatantelor de cultură A375 asupra producției de IL-12 și TNF-α a MoDCs tratate cu LPS a fost restabilită prin pretratarea celulelor A375 fie cu RNAi care vizează doar BRAFV600E, fie doar STAT3, fie atât BRAFV600E, cât și STAT3 (Fig. 4 b). Deși RNAi STAT3 a părut să reducă activitatea supresivă a supernatantelor de cultură A375 mai mult decât RNAi BRAFV600E, diferența poate fi cauzată pur și simplu de activitățile diferite ale RNAi. Cu toate acestea, este important de remarcat faptul că nu au fost observate efecte aditive și sinergice prin RNAi care vizează simultan BRAF și STAT3; din nou, ceea ce indică rolurile esențiale ale ambelor căi de semnalizare în producerea de factori supresivi asupra maturării DC. Deși a fost raportată activarea DC de către supernatantul din linia celulară murină CT26 de cancer de colon transfectată cu o formă dominantă negativă a STAT3, posibil prin creșterea producției de citokine proinflamatorii, în acest studiu nu s-a observat activarea DC. Aceasta poate fi explicată printr-o inhibiție incompletă a BRAF și STAT3, prin lipsa unei producții crescute de citokine proinflamatorii în celulele de melanom transfectate cu BRAF shRNA, sau prin diferențe între celulele tumorale sau specii.
În rezumat, am demonstrat pentru prima dată un rol esențial al semnalizării MAPK împreună cu calea STAT3 asupra producției de diverși factori imunosupresori în liniile celulare de melanom cu MAPK constitutiv activ datorită mutației comune BRAFV600E. Astfel, calea MAPK poate fi o țintă moleculară potențial semnificativă pentru depășirea evaziunii imunitare a diferitelor tipuri de cancer, deoarece este activată frecvent în mai multe tipuri de cancere, inclusiv în melanomul fără mutația BRAFV600E (16, 17).
.