Obiectivul general al acestei proceduri este de a extrage secvențial ARN-ul și ADN-ul din nucleele de țesut de arhivă fixate în formol și încorporate în parafină. Acesta este un protocol de recoltare a nucleelor de țesut din care vom extrage atât ARN, cât și ADN. Principalul avantaj al acestui protocol este că îmbunătățește producția de ARN și ADN din regiuni precis țintite din blocul de țesut.

Acest procedeu este dezvoltat în mare parte în țesuturile arhivate de cancer de prostată. Ea poate fi aplicată și la alte tipuri de țesuturi de arhivă. Demonstrația vizuală a acestei metode este esențială, deoarece etapele de carotare a țesuturilor nu sunt utilizate în mod obișnuit în laboratoarele de cercetare.

Majoritatea laboratoarelor de cercetare utilizează în schimb secțiuni transversale, care epuizează țesuturile mai repede și adaugă o eterogenitate semnificativă la eșantion. Începeți prin examinarea lamei microscopului și conturarea regiunii de interes cu ajutorul unui marker permanent cu vârf fin. Apoi, tăiați o secțiune de peliculă de parafină suficient de mare pentru a acoperi regiunea de interes de pe lamă de microscop.

Apoi, așezați ferm pelicula pe lamă, înfășurând pelicula pe margini pentru a o împiedica să alunece. Folosind un marker permanent cu vârf fin, conturați întregul țesut și regiunea de interes din interiorul țesutului. Apoi, îndepărtați filmul de pe lamă și transferați-l pe blocul de țesut corespunzător.

Orientați filmul prin răsturnarea sau rotirea acestuia astfel încât conturul întregului țesut să corespundă formei observate a țesutului din bloc. Apăsați ferm secțiunea de film pe suprafața blocului pentru a preveni alunecarea. Folosind vârful markerului permanent, faceți crestături puțin adânci, dar vizibile, de-a lungul conturului regiunii de interes și apoi îndepărtați filmul.

În continuare, curățați punch-ul receptor din setul de punch-uri de 0,6 milimetri prin scufundarea vârfului în tubul de microcentrare de 1,5 mililitri care conține un mililitru de înălbitor și prin alunecarea punch-ului în sus și în jos de mai multe ori. Se repetă spălarea cu tubul care conține etanol de 70 % și apoi cu apă. Acum, apăsați pumnul curățat în regiunea de interes până la o adâncime de trei milimetri și retrageți-l.

Liberați miezul într-un tub de micro centrifugă cu grad scăzut de legare, împingându-l cu stiloul în afara pumnului. Se adaugă un mililitru de xilen în tuburile de microcentrifugare care conțin nucleele de țesut și se vortexează energic timp de zece secunde. Apoi se introduc într-un bloc termic setat la 50 grade Celsius timp de trei minute.

După incubare, se centrifughează timp de două minute la temperatura camerei la viteză maximă. După centrifugare, puneți miezurile pe gheață timp de cinci minute pentru a solidifica reziduul ceros. Acum, îndepărtați cu grijă parafina care s-a acumulat în jurul meniscului împreună cu supernatantul folosind un vârf de pipetă.

Apoi, repetați tratamentul cu xilen. După îndepărtarea amestecului de parafină și xilenă, adăugați un mililitru de etanol 100 % și amestecați energic în vortex timp de zece secunde. După centrifugarea la viteză maximă timp de două minute, aruncați cu grijă etanolul.

Repetați încă o dată spălarea cu etanol înainte de a începe omogenizarea. Resuspendați miezurile deparafinate în 700 microlitri de etanol 100 % înainte de omogenizare. Folosiți un omogenizator de țesuturi motorizat pe o setare medie pentru a mărunți miezurile în particule fine.

Omogenizarea temeinică a miezurilor de țesut este necesară pentru un randament optim de ADN și ARN. Apoi, umpleți tuburi separate de 15 mililitri cu aproximativ zece mililitri de înălbitor, soluție de neutralizare a RNazei și etanol de 70 %. După omogenizarea probei, spălați sonda de omogenizare în fiecare dintre soluțiile de curățare, în ordine.

Rulați omogenizatorul la cea mai mare viteză în timpul etapei de spălare. Ștergeți sonda cu un șervețel și lăsați sonda să se usuce complet înainte de omogenizarea următoarei probe. Inspectați vizual lamele sondei pentru bucăți de țesut reziduale și, dacă se găsesc, curățați din nou sonda.

După omogenizare, aduceți volumul probei la un mililitru cu etanol 100 %, apoi centrifugați la viteză maximă timp de 15 minute. Se aspiră cu grijă etanolul și se usucă la aer peleții timp de aproximativ 15 până la 20 de minute înainte de a începe extracția cu proteinază K. Resuspendați granulele în 150 microlitri de tampon de digestie cu proteinază K și agitați tuburile pentru a desprinde granulele.

Se recomandă digestia cu proteinază K peste noapte pentru o recuperare mai mare de ADN. Se adaugă 10 microlitri de proteinază K stabilă la temperatură și se amestecă prin batere. Se incubează la 56 grade Celsius timp de 15 minute cu agitare ușoară.

Incubați tuburile la gheață timp de trei minute. După răcire, centrifugați tubul timp de 15 minute la viteză maximă. Apoi, fără a deranja granulele, transferați cu grijă fiecare supernatant într-un nou tub de micro centrifugă pentru purificarea ARN.

Extrageți ARN și ADN utilizând procedura optimizată din protocolul scris, care include un timp de digestie tisulară prelungit pentru extracția ADN. ARN și ADN pot fi recuperate din eșantioane mai vechi de țesut fixate în formol și înglobate în parafină folosind această metodă. Acizii nucleici au fost coextrași din eșantioane de cancer de prostată cu vârste cuprinse între trei și 14 ani.

Rezultatul mediu a fost de 2, 270 nanograme de ARN și 820 nanograme de ADN. În mod interesant, nu a existat o corelație semnificativă între vârsta probei de țesut și recuperarea acizilor nucleici. În general, randamentele de ARN și ADN au fost corelate între probe, deși, în majoritatea cazurilor, a fost recuperat mai mult de două ori mai mult ARN în raport cu ADN.

Pentru a demonstra performanța ADN genomic extras cu acest protocol, extractele de ADN convertite cu bisulfit din probe arhivate de cancer de prostată au fost amplificate prin PCR specific de metilare. Elementele repetitive ALU au fost utilizate ca un control de metilare și au prezentat puține variații între probe. GSTP1, o genă cunoscută ca fiind hipermetilată în cancerul de prostată, nu a prezentat o amplificare detectabilă prin PCR specifică de metilare atunci când a fost utilizat ADN extras din probe benigne.

Eșantioanele de ADN de la pacienții cu cancer de prostată agresiv au prezentat valori detectabile ale pragului de ciclu QPCR care au fost mai mici decât cele din celulele cancerului de prostată indolent, ceea ce indică o metilare crescută a GSTP1 în cancerul de prostată agresiv. Odată stăpânită, această tehnică poate fi realizată în trei-patru ore pentru ARN și, după digestia de peste noapte, în patru ore pentru ADN, dacă este realizată în mod corespunzător. Această tehnică ar trebui să permită cercetătorilor din domeniul patologiei moleculare să exploreze biomarkerii ADN și ARN de diagnosticare într-o varietate de cancere.

După vizionarea acestui videoclip, ar trebui să aveți o bună înțelegere a modului de pregătire a nucleelor de țesut pentru extracția de ADN și ARN din zonele de interes cartografiate cu precizie în blocurile de țesut de arhivă.

.