Mathis a început să joace în mod profesionist la vârsta de 16 ani. Primul ei loc de muncă a fost o reclamă pentru “Always Slender Pads – Just for Teens”. A jucat în serialele de televiziune Aaron’s Way și Knightwatch între 1988 și 1989. Primul ei rol principal într-un lungmetraj a fost cel al Norei din Pump Up the Volume (1990), alături de Christian Slater, cu care s-a întâlnit pentru scurt timp la acea vreme. Mathis și-a vopsit părul blond natural în negru pentru acest rol, într-un efort de a-și schimba imaginea de la dulce și inocentă la voință puternică.

Mathis a apărut în filmele de televiziune Extreme Close-up, 83 Hours ’til Dawn și To My Daughter în 1990. Mathis și Slater au avut roluri vocale în filmul de animație FernGully: The Last Rainforest: The Last Rainforest (1992). A apărut apoi în comedia This Is My Life (1992), scrisă și regizată de Nora Ephron, interpretând rolul unei adolescente nesigure. Mathis a apărut în piesa de teatru Fortinbras la New York în octombrie 1992. Super Mario Bros. (1993), în care a interpretat-o pe Prințesa Daisy din popularul joc video Nintendo, a fost o bombă de box-office, dar a câștigat un cult de la lansare.

Mathis l-a întâlnit pe actorul River Phoenix pe platoul de filmare al filmului The Thing Called Love (1993) și cei doi au început o relație. Ea a fost cu Phoenix pe 31 octombrie 1993, în noaptea în care acesta a murit la spitalul Cedars-Sinai din cauza unei supradoze de droguri, după ce s-a prăbușit în fața localului Viper Room din West Hollywood. Ea a realizat filmul Jack and Sarah (1995), care a fost filmat la Londra, pentru a pleca din țară după moartea lui Phoenix din cauza acoperirii excesive a presei.

Mathis a apărut în 1994 în adaptarea cinematografică a filmului Little Women, și în How to Make an American Quilt (1995), ambele cu Winona Ryder în rolul principal. A apărut apoi în The American President (1995), jucând rolul asistentei președintelui Statelor Unite. Mathis a jucat din nou alături de Christian Slater, alături de John Travolta, în filmul Broken Arrow (1996) al lui John Woo. Și-a luat o pauză de puțin peste un an de la actorie după ce mama ei a murit în 1996 din cauza cancerului la sân.

Mathis a apărut ulterior în American Psycho (2000), o adaptare cinematografică a romanului cu același nume din 1991 al lui Bret Easton Ellis. Ea a jucat în Attraction (2000), și în The Simian Line (2001). A jucat în miniseria de televiziune TNT The Mists of Avalon (2001). Mathis a jucat alături de Thomas Jane în The Punisher (2004). A avut un rol de invitată în serialul de televiziune Lost de pe ABC, în rolul Oliviei Goodspeed. A jucat rolul fiicei lui Jane Fonda în spectacolul de pe Broadway “33 Variations”. Filmul ei independent Lebanon, PA a avut premiera mondială la Festivalul de film SXSW din 2010. A apărut într-o producție off-Broadway a piesei “Love, Loss, and What I Wore” (Dragoste, pierdere și ce am purtat), la Westside Theatre din New York, în octombrie 2011.

În 2013, Mathis a jucat rolul psihiatrului Alice Calvert în serialul de televiziune al CBS “Under the Dome”, bazat pe un roman de Stephen King. În 2014, s-a alăturat distribuției serialului dramatic horror FX The Strain în rolul lui Justine Feraldo, o consilieră din New York pentru Staten Island.

În 2019, Mathis a apărut Off-Broadway în rolul lui Kate Conlee în Make Believe, o nouă piesă de Bess Wohl pusă în scenă la Second Stage Theater. Michael Greif a regizat.

Muzicalul ei din 2020, Whisper House, a fost amânat din cauza pandemiei COVID-19.

.