Implicație clinică

Instabilitatea microsateliților (MSI) rezultă din acumularea sistematică de deleții/inserții în secvențe scurte de ADN repetitive în celulele tumorale cu un sistem de reparare a nepotrivirii (MMR) deficitar. MSI apare în aproximativ 15% din toate cancerele colorectale și este utilă din punct de vedere clinic pentru identificarea pacienților cu cancer colorectal ereditar nepolipozant (HNPCC, sindromul Lynch) cauzat de mutații germinale ale genelor MMR. Statutul MSI poate, de asemenea, să prezică răspunsul/rezistența cancerului la anumite chimioterapii.

În încercarea de a standardiza analiza MSI, un atelier de lucru al Institutului Național de Cancer (NCI) din 1997 a recomandat un panel de referință de cinci markeri microsateliți pentru detectarea MSI și a stabilit liniile directoare de clasificare a MSI pe baza rezultatelor. Panoul de referință, denumit panoul Bethesda, este format din doi loci mononucleotidici (Big Adenine Tract sau BAT-25 și BAT-26) și trei loci dinucleotidici (D2S123, D5S346 și D17S250). Utilizând panoul Bethesda, cancerele cu instabilitate la 2 sau mai mulți dintre acești loci au fost interpretate ca MSI-high (MSI-H), iar cancerele fără instabilitate la oricare dintre cei cinci loci au fost considerate stabile la microsateliți (MSS). În cadrul unui alt atelier NCI de monitorizare, s-a recunoscut faptul că sensibilitatea și specificitatea panoului Bethesda inițial ar putea fi limitate din cauza includerii repetițiilor dinucleotide, care sunt mai puțin sensibile și specifice decât repetițiile mononucleotide pentru identificarea cancerelor cu deficiențe MMR. S-a sugerat că un panou de repetări mononucleotidice cvasiimonomorfe, ar putea fi suficient de sensibil și specific pentru detectarea cancerelor cu MSI ridicat și ar putea evita necesitatea de a avea ADN normal de potrivire pentru tumorile testate (1-8).

MSI Analysis System (Research Use Only kit, Version 1.2, Promega Corporation).

Sistemul MSI Analysis System este un test multiplex, bazat pe PCR fluorescent pentru detectarea instabilității microsateliților. MSI Analysis System include amorse marcate fluorescent pentru co-amplificarea a cinci markeri mononucleotidici cvasiimonomorfici repetați (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 și MONO-27). Produsele PCR sunt separate prin electroforeză capilară (CE) cu ajutorul unui analizor genetic Applied Biosystems 3500Dx. Instabilitatea microsateliților la 2 sau mai mulți loci mononucleotidici este interpretată ca MSI-high; instabilitatea microsateliților la un singur locus mononucleotidic sau lipsa instabilității la oricare dintre loci testați este interpretată ca microsatelit stabil (MSS). În mod obișnuit, eșantioanele cu MSI ridicat prezintă instabilitate la toți loci, cu o scădere medie a dimensiunii produsului de 5 până la 9 baze. Prezența MSI este detectată cu o specificitate analitică de cel puțin 99% și o limită de detecție de cel puțin 5%.

O caracteristică importantă de proiectare a sistemului de analiză MSI este distanța dintre cei cinci loci diferiți, care, în general, depășește numărul tipic de baze deplasate (în medie 5 până la 9 baze) atunci când este prezentă MSI. Cea mai lungă dimensiune a ampliconului PCR este de 154 de perechi de baze, ceea ce este avantajos pentru analiza țesuturilor fixate în formol și încorporate în parafină (FFPE).

Acest test este standardul pentru testarea MSI de rutină de mare randament, în special atunci când sunt solicitate alte teste moleculare în aval pe aceeași probă de ADN.

Specimen requirements

Specimenele acceptabile pentru acest test sunt specimene de țesut de carcinom colorectal fixate în formol, încorporate în parafină, cu un timp de fixare de 6-48 de ore.

Volum

Se preferă un bloc de parafină reprezentativ. Alternativ, pentru probele de rezecție este necesar un minim de 5 secțiuni de țesut necolorate (cu grosimea de 5 µm).

Instrucțiuni de depozitare și expediere

Conservați și expediați probele la temperatura ambiantă.

Limitări

Conținutul tumoral insuficient poate să nu permită detectarea instabilității MSI: este necesar 10% din celulele tumorale. Conținutul tumoral este evaluat înainte de analiză și se efectuează o macrodisecție. Fixativii, alții decât formolul sau timpul de fixare prelungit, pot da naștere la rezultate inadecvate.

Exigențe speciale

Niciuna.

Termen de predare

Cinci până la 7 zile lucrătoare pentru lame, respectiv blocuri de parafină.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Acreditare în curs de acreditare

Proba IdyllaTM MSI Assay (RUO) realizează detectarea instabilității microsateliților direct din secțiuni de țesut de cancer uman fixate în formol și încorporate în parafină (FFPE) utilizând o reacție PCR urmată de analiza curbei de topire de înaltă rezoluție pe un instrument IdyllaTM.

Atestarea realizează detectarea mutațiilor în 7 loci homopolimeri monomorfi pentru identificarea cancerelor umane cu instabilitate a microsateliților (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A și SULF2). Acești biomarkeri sunt specifici tumorilor, prezintă o frecvență ridicată în cancerele colorectale și endometriale și sunt stabili în diferite etnii. În plus, acești biomarkeri specifici tumorilor nu necesită analiza probelor de țesut normal împerecheate.

Starea MSI pentru o probă este determinată cu apelul final pentru toți cei 7 biomarkeri. Instabilitatea microsateliților la 2 sau mai mulți loci mononucleotidici este interpretată ca MSI-înaltă; instabilitatea microsateliților la un singur locus mononucleotidic sau lipsa instabilității la oricare dintre loci testați este interpretată ca microsatelit stabil (MSS).

Acest test permite testarea MSI cu randament scăzut și este ideal pentru testarea reflexă sau de salvare pentru a obține sau confirma rapid un rezultat MSI precis.

Specimen requirements

Specimenele acceptabile pentru acest test sunt specimene de țesut de carcinom colorectal fixate în formol și incluse în parafină, cu un timp de fixare de 6-48 de ore.

Volum

Se preferă 1 bloc de parafină reprezentativ. Alternativ, pentru specimenele de rezecție este necesar un minim de 2 secțiuni de țesut necolorate (5 µm grosime; 50-600mm²).

Instrucțiuni de depozitare și expediere

Mențineți și expediați specimenele la temperatura ambiantă.

Limitări

Conținutul insuficient al tumorii poate să nu permită detectarea instabilității MSI: este necesar 20% din celulele tumorale. Conținutul tumoral este evaluat înainte de analiză și se efectuează o macrodisecție. Fixatorii, alții decât formolul sau timpul de fixare prelungit, pot da naștere la rezultate inadecvate.

Exigențe speciale

Niciuna.

Termen de predare

Trei până la 5 zile lucrătoare pentru lamele, respectiv blocuri de parafină.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers (Comparație între sistemul de analiză a instabilității microsateliților și panoul Bethesda pentru determinarea instabilității microsateliților în cancerele colorectale). Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Repetiții mononucleotidice quasimonomorfe pentru analiza instabilității microsateliților la nivel înalt. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detectes microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Detectarea instabilității microsateliților (MSI) în probele de cancer colorectal cu un nou set de markeri foarte sensibili prin intermediul prototipului IdyllaTM MSI Test. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Actualizat la 23 mai 2019

.