Abstract

Au fost evaluate efectele zincului, magneziului și calciului din plasma seminală asupra timpului până la sarcină (TTP) la cuplurile sănătoase, asupra parametrilor seminale convenționale și asupra parametrilor analizei seminale asistate de calculator (CASA). Localizarea ionilor de zinc chelabili în plasma seminală și în spermatozoizi a fost evaluată prin autometalografie (AMG). Au fost evaluate diferențele în localizarea zincului chelatabil în probele cu zinc total ridicat și scăzut. Probele de material seminal de la 25 de cupluri cu TTP scurt și 25 de cupluri cu TTP lung au fost supuse analizei convenționale a materialului seminal, CASA, măsurători de zinc și magneziu prin spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv și calciu prin spectrometrie de absorbție atomică cu flacără. Cationii au fost puternic intercorelați, dar nu s-a constatat nicio corelație cu TTP sau cu parametrii convenționali ai materialului seminal. Probele de material seminal cu concentrații ridicate de zinc au prezentat o motilitate mai slabă din punct de vedere statistic, evaluată prin parametrii CASA – viteza și liniaritatea liniei drepte – decât probele cu un conținut scăzut de zinc. Concentrația de calciu a prezentat, de asemenea, diferențe semnificative din punct de vedere statistic pentru aceiași parametri, dar efectul a fost eliminat prin introducerea concentrației de zinc într-un model de regresie multiplă. Probele de material seminal cu un conținut ridicat de zinc total au prezentat o colorare mai puternică a plasmei seminale la AMG. Se sugerează că concentrațiile ridicate de zinc seminal au un efect supresor asupra motilității progresive a spermatozoizilor (`calitatea mișcării’), dar nu și asupra procentului de spermatozoizi mobili (`cantitatea mișcării’).

Introducere

Conținutul total de zinc în materialul seminal de la mamifere este ridicat, iar zincul s-a dovedit a fi esențial pentru spermatogeneză. Deficitul de zinc este asociat cu hipogonadismul și dezvoltarea insuficientă a caracteristicilor sexuale secundare la om (Prasad, 1991) și poate cauza atrofia tubilor seminiferi la șobolan și, prin urmare, eșecul spermatogenezei (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). S-a raportat că concentrațiile ridicate de zinc scad absorbția de oxigen în spermatozoizii (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990), precum și reacția acrozomului indusă de albumină (Foresta et al., 1990). Atașarea/detașarea cap-coadă și condensarea/decondensarea cromatinei nucleare sunt, de asemenea, influențate de zincul seminal (Kvist, 1980; Bjorndahl și Kvist, 1982). Au existat rapoarte contradictorii privind efectul zincului seminal asupra motilității spermatozoizilor (Stankovic și Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). S-a demonstrat că chelarea ionilor de zinc afectează motilitatea spermatozoizilor (Saito et al., 1967; Danscher și Rebbe, 1974) și s-a sugerat că zincul biodisponibil legat de proteinele veziculare cu greutate moleculară mare, mai degrabă decât zincul seminal total, ar trebui să fie o măsură a efectului zincului asupra funcției spermatozoizilor (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Acest studiu se concentrează în principal asupra zincului. A fost evaluată asocierea zincului seminal și, într-o anumită măsură, a magneziului și calciului, cu timpul până la sarcină (TTP) la cuplurile sănătoase. Mai mult, a fost evaluată corelația dintre acești cationi divalenți cu parametrii convenționali ai materialului seminal și cu parametrii analizei spermei asistate de calculator (CASA).

Autometalografia (AMGZn) este o metodă histochimică pentru detectarea ionilor de zinc și a ionilor de zinc slab legați (zinc chelatabil) în țesuturi. Au fost investigate diferențele de localizare a ionilor de zinc la nivel microscopic ușor și microscopic electronic în spermatozoizii și plasma seminală de la bărbații cu zinc total ridicat și zinc total scăzut.

Materiale și metode

Populația studiată

Au fost recrutate în total 430 de cupluri din 52 255 de membri a patru sindicate. S-au obținut probe de material seminal de la cele 430 de cupluri, motilitatea a fost evaluată manual și prin CASA (a se vedea mai târziu), iar probele au fost păstrate congelate (-20°C) până la analiza ulterioară. Cuplurile fără experiență reproductivă anterioară au fost înrolate în momentul în care au întrerupt contracepția și au fost urmărite timp de cel puțin șase cicluri menstruale complete sau până când a fost recunoscută sarcina . Din cele 430 de cupluri, 50 de cupluri care au rămas însărcinate au fost selectate pentru prezentul studiu: cele 25 de cupluri cu cel mai scurt TTP (S-TTP, mediana 1 lună, interval 1-2 luni) și cele 25 de cupluri cu cel mai lung TTP (L-TTP, mediana 10 luni, interval 7-28 luni). Probele de material seminal de la aceste 50 de cupluri au fost supuse analizelor menționate mai jos.

Caracteristici convenționale ale materialului seminal

Probele de material seminal au fost obținute prin masturbare în borcane de polistiren sterile de 50 ml după 3 zile de abstinență recomandate. După lichefiere, probele au fost analizate la temperatura camerei în conformitate cu criteriile Organizației Mondiale a Sănătății (1992).

Volumul a fost măsurat într-un tub de sticlă Falcon gradat de 10 ml (precizie de 0,1 ml). Evaluările manuale ale motilității spermatozoizilor au fost efectuate într-o cameră de numărare Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Fiecare spermatozoid întâlnit a fost clasificat după cum urmează: a: motilitate progresivă rapidă, b: motilitate progresivă lentă sau lentă, c: motilitate neprogresivă, d: imotilitate. S-au efectuat cel puțin 2×100 scoruri. În cazul în care diferența dintre două numărători consecutive depășea 10%, s-au efectuat două noi numărători. Procentul de spermatozoizi motili a fost definit ca fiind grupurile `a + b + c’. Concentrația a fost măsurată într-o cameră de numărare Makler, iar morfologia a fost clasificată în conformitate cu criteriile “stricte” Tygerberg descrise de Kruger et al. (1986) pe frotiuri uscate la aer fixate în etanol și eter, colorate prin tehnica lui Papanicolaou (Organizația Mondială a Sănătății, 1992). Notarea morfologiei a fost efectuată de un singur tehnician de laborator calificat. Viabilitatea spermatozoizilor a fost determinată pe frotiuri colorate cu eozină-negrosină.

Analiza spermei asistată de calculator

Materialul pentru CASA a fost obținut după cum urmează: 4,5 μl de spermatozoizi proaspeți, bine amestecați, au fost transferați cu o pipetă într-o cameră de numărare Makler cu o adâncime de 10 μm. Proba a fost plasată într-un microscop cu contrast de fază Olympus BH-2 (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Danemarca) cu o placă de încălzire (37°C) la o mărire de ×200. O cameră video Sony DXC-107 (Sony Corp., Tokyo, Japonia) a transferat imaginile pe un monitor video color Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tokyo, Japonia). Înregistrările imaginilor au fost făcute pe un casetofon video JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tokyo, Japonia). Înregistrările au fost analizate ulterior pe un Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, Regatul Unit) la o frecvență de achiziție de 25 Hz, timp de urmărire de 2 s (total de 50 de cadre), câmp vizual de 300×300 μm (permițând detectarea tuturor valorilor vitezei în linie dreaptă de până la 150 μm/s). S-au analizat 100 de spermatozoizi pentru fiecare probă.

Din analize au fost derivați următorii parametri: viteza curbilinie (VCL), viteza în linie dreaptă (VSL), liniaritatea (LIN), viteza medie de deplasare (VAP) și amplitudinea deplasării laterale a capului (ALH).

Determinarea zincului, magneziului și calciului în spermă

Zincul, magneziul și calciul seminal au fost măsurate în toate cele 50 de probe. Concentrațiile de zinc și magneziu din material seminal au fost determinate prin spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS). Instrumentul a fost un PQ2+ de la Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, Regatul Unit). O alicotă de 20 μl a fost diluată de 100 de ori cu o soluție care conține 5 g/l de amoniac 25% (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgia) și 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, SUA) în apă Millipore de 18 MW. Ca standard intern, s-a adăugat scandiu (AccuStandard, New Haven, CT, SUA) la o concentrație finală de 100 μg/l. Toate probele au fost preparate în dublu exemplar. Calibrarea a fost efectuată folosind probe martor, la care s-au adăugat zinc și magneziu (AccuStandard) la concentrații finale de 1, 2 și 3 mg/l, care corespund concentrațiilor de 100, 200 și 300 mg/l în probele de material seminal originale. Această analiză a fost efectuată în modul “peak jumping” cu măsurători la 24Mg, 66Zn și 45Sc.

Determinarea calciului a fost efectuată în aceleași preparate cu ajutorul spectrometriei de absorbție atomică cu flacără (FAAS). Instrumentul a fost un Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, SUA). Calibrarea a fost efectuată pentru concentrații corespunzătoare la 100, 200 și 400 mg/l în probele originale de material seminal. Probele cu concentrații ridicate de calciu au fost diluate de trei ori mai mult pentru a se încadra în curba de calibrare.

Limitele de detecție, calculate ca fiind de trei ori abaterea standard pentru 10 probe martor pregătite cu aceeași ocazie cu probele, au fost de 1 mg/l pentru zinc, 3 mg/l pentru magneziu și 2 mg/l pentru calciu (exprimate ca și concentrații în probele de material seminal nediluate). Coeficienții globali de variație în determinări, calculați pe baza rezultatelor analizelor în duplicat, au fost de 18% pentru zinc, 32% pentru magneziu și 17% pentru calciu.

S-au făcut, de asemenea, preparate pentru determinarea zincului prin spectrometrie de absorbție atomică cu flacără (FAAS) în zece dintre probe. Analiza de regresie liniară a rezultatelor ICP-MS versus FAAS a dat o pantă de 0,79 (interval de încredere de 95%: 0,58-1,00), o interceptare de 13 μg/l și r2 de 0,90. Rezultatele ceva mai ridicate pentru analizele ICP-MS nu au fost, prin urmare, semnificative din punct de vedere statistic.

Dezvoltarea autometalografică (AMG) a frotiurilor de material seminal pentru analiza la microscopul optic

Cinci probe cu un conținut ridicat (242-308 mg/l) și 5 cu un conținut scăzut (38-57 mg/l) de zinc, determinat prin ICP-MS, au fost incubate în sulfură de sodiu 0,5% (Bie & Berntsen) timp de 30 min pentru a crea rețele de sulfură de zinc. S-au făcut frotiuri din soluția de ejaculat/sulfură pe lame de sticlă clătite Farmer . Frotiurile au fost uscate la aer, fixate în glutaraldehidă 3% (Bie & Berntsen) timp de 30 min și plasate în tampon fosfat 0,1 M timp de 3×2 min și o dată în apă distilată timp de 2 min.

Frotiurile au fost apoi developate cu AMG pentru a amplifica cu argint rețelele de sulfură de zinc. Dezvoltatorul a constat din 60 ml de soluție filtrată de gumă arabică (1 kg dizolvată în 2 l de apă distilată; Bidinger A/S, Aarhus, Danemarca), 10 ml de tampon citrat de sodiu și 0,85 g de hidrochinonă (Merck, Darmstadt, Germania) dizolvată în 15 ml de apă caldă distilată. Imediat înainte de utilizare, s-a adăugat 0,11 g de lactat de argint (Fluka, Buchs, Elveția) în 15 ml de apă distilată și soluția a fost amestecată bine.

Bucsoarele clătite la fermă care conțineau frotiurile de material seminal au fost plasate într-o baie de apă la 26°C și transferate într-o cutie etanșă la lumină. Dezvoltatorul AMG nou preparat a fost turnat în borcane, iar frotiurile au fost developate timp de 30 de minute în cutia întunecată.

După dezvoltare, frotiurile au fost clătite în apă curentă deionizată timp de 10 minute, plasate în tiosulfat de sodiu 5% timp de 5 minute, spălate cu apă curentă deionizată timp de 2 minute, post-fixate cu etanol 70% timp de 30 de minute și, în final, spălate cu apă curentă deionizată timp de 2 minute. Contracolorarea s-a efectuat cu o soluție apoasă de albastru de toluidină 0,1%, pH 4,0 (1 g de albastru de toluidină în 1000 ml de tampon: 614,5 ml de acid citric monohidrat 0,1 M și 385,5 ml de hidrogenofosfat de di-sodiu dihidrat 0,2 M; Merck, Darmstadt, Germania). Frotiurile au fost plasate timp de 2 × 2 min în apă distilată, 3 × 3 min în etanol 99%, 3×3 min în xilol și, în final, au fost montate cu DEPEX (Merck, Darmstadt, Germania).

Prepararea frotiurilor de spermă pentru analiza la microscopul electronic

Frotiurile de probe de spermă au fost pregătite așa cum s-a descris mai sus, cu excepția faptului că nu au fost montate cu DEPEX. După procedură s-a adăugat 0,5% tetroxid de osmiu timp de 30 min, iar frotiurile au fost plasate timp de 3×2 min în tampon și 1×2 min în apă distilată. Frotiurile contrastate cu osmiu au fost studiate la microscopul optic, iar zonele de interes pentru analize microscopice electronice ulterioare au fost marcate cu un cuțit de diamant.

Frotiurile selectate au fost deshidratate în soluții de etanol gradat și încorporate în Epon (Bie & Berntsen). Blocurile de Epon plasate deasupra zonelor de interes marcate anterior au fost menținute la 60°C timp de 24 h și apoi s-au rupt frotiurile de sticlă. Au fost tăiate secțiuni semi-subțiri (3 μm) și plasate pe lame de sticlă. După analizele la microscopul optic, secțiunile selectate au fost reîncorporate în Epon, iar secțiunile ultra-subțiri au fost realizate și contracolorate cu citrat de plumb înainte de a fi examinate la un microscop electronic JEOL 100S.

Metode statistice

Analizele de regresie multiplă au fost aplicate datelor pentru a detecta impactul parametrilor individuali asupra rezultatului. Coeficienții de corelație de rang Spearman au fost calculați pentru mai multe corelații. Pentru compararea grupurilor s-a efectuat testul Wilcoxon rank-sum pentru diferența dintre mediane.

Rezultate

În tabelul I sunt prezentate conținuturile de zinc, magneziu și calciu, împreună cu proporția relativă a cationilor în plasma seminală. Compararea medianelor pentru acești parametri în cele două grupuri S-TTP versus L-TTP prin teste t cu două eșantioane nu a evidențiat diferențe semnificative din punct de vedere statistic pentru niciunul dintre acești parametri. S-a constatat o intercorelație pozitivă puternică între zinc, magneziu și calciu (coeficienții de corelație de rang Spearman au fost de 0,79-0,86, P < 0,01) (Figura 1).

Niciun cation nu a fost strâns corelat cu niciunul dintre parametrii convenționali ai materialului seminal. La efectuarea analizei de regresie multiplă pe toate datele, doar conținutul de zinc a ieșit cu o valoare P sub 0,05 pentru următorii parametri CASA: VSL 0,04, și LIN 0,008. Introducerea în model a magneziului sau a calciului nu a îmbunătățit valorile.

Eșantioanele de material seminal au fost împărțite în două grupe de mărime egală în funcție de statutul cationic al fiecărui cation. Au fost identificate următoarele puncte de divizare (mediane pentru toate cele 50 de probe): zinc 112 mg/l, magneziu 98 mg/l și calciu 476 mg/l. Au fost detectate o serie de diferențe semnificative din punct de vedere statistic între cele două grupuri (tabelul II). Valorile P pentru grupurile de zinc au indicat cele mai mari diferențe, grupurile de calciu având diferențe intermediare, iar grupurile de magneziu prezentând doar diferențe slabe (cu excepția LIN).

Pentru proporția relativă dintre cationi (tabelul III), punctele de divizare au fost: zinc:magneziu 1,26 și zinc:calciu 0,22. Probele cu un raport zinc:calciu mai mare de 0,22 au prezentat valori mai mici, semnificative din punct de vedere statistic, pentru parametrii CASA VSL, LIN și STR, în comparație cu probele cu un raport mai mic de 0,22. Corelația zinc:magneziu este de 0,86 (coeficientul de corelație de rang Spearman), iar pentru zinc:calciu este de 0,79. Conținutul de zinc pare să fie mai strâns asociat cu conținutul de magneziu decât cu cel de calciu, ceea ce ar putea explica diferența dintre grupuri.

La evaluarea conținutului de ioni de zinc în preparatele AMG, s-a detectat o diferență la nivel microscopic ușor în probele cu zinc total scăzut în comparație cu probele cu zinc total ridicat. Figura 2 arată diferențele de colorare a AMG într-o probă cu 299 mg/l și o probă cu 53 mg/l de zinc seminal. Colorarea în jurul acrozomului, a cozii și în plasma seminală s-a dovedit a fi rară în probele cu zinc total scăzut. Nu a fost posibilă confirmarea acestor constatări la nivelul microscopului electronic (figura 3A) și, în special, nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește colorarea intracelulară a spermatozoizilor. Figurile 3B și 4 prezintă localizarea ionilor de zinc în coada spermatozoizilor. Acesta se găsește în toată coada, concentrat în fibrele accesorii flagelare și în membrană. În plasma seminală s-au găsit corpuri de dimensiuni micrometrice bogate în conținut de ioni de zinc (Figura 5).

Discuție

Din câte știm noi, acesta este primul studiu care evaluează impactul zincului, magneziului și calciului seminal asupra parametrilor TTP și CASA la ființe umane sănătoase. S-a constatat o asociere între concentrațiile ridicate de zinc și liniaritatea scăzută a mișcărilor spermatozoizilor, exprimată printr-o scădere a VAP, VSL, STR și LIN. Concentrațiile de magneziu și calciu au fost strâns corelate cu concentrația de zinc, dar nu au fost la fel de puternic asociate cu parametrii CASA. S-a constatat că concentrația mobilă nu a fost afectată de concentrația totală de zinc, magneziu și calciu. Cu toate acestea, s-au constatat diferențe între un conținut ridicat față de un conținut scăzut de zinc și unii parametri CASA (tabelul II). Atunci când s-a comparat cele 25 de probe de material seminal cu cel mai scăzut nivel total de zinc (mediana de 72 mg/l) cu cele 25 de probe cu cel mai ridicat nivel total de zinc seminal (mediana de 187 mg/l), testul Wilcoxon rank-sum a evidențiat o diferență semnificativă din punct de vedere statistic între medianele pentru VSL (P = 0,004), precum și pentru LIN (P = 0,001). Pentru VAP, diferența a fost, de asemenea, semnificativă (P = 0,02). Nu s-a constatat nicio diferență pentru VCL. Deoarece nu au existat diferențe în ceea ce privește procentul de motilitate sau concentrația de motilitate în probele cu conținut scăzut și ridicat de zinc, se pare, prin urmare, că un mediu bogat în zinc face ca spermatozoizii să se miște într-un mod mai aleatoriu și mai puțin înainte. Nu pare să reducă numărul de spermatozoizi mobili.

VSL exprimă cât de mult în linie dreaptă se deplasează spermatozoizii într-un anumit interval de timp și este cel mai probabil, din punct de vedere clinic, să fie cel mai important parametru CASA. Un studiu realizat de Moore și Akhondi (1996) privind capacitatea de fertilizare a spermatozoizilor de șobolan epididimar a arătat că o scădere a VSL este puternic corelată negativ cu rezultatul fertilizării in vitro.

De-a lungul anilor au existat multe dezbateri privind rolul zincului din plasma seminală asupra funcțiilor spermatozoizilor. Capul spermatozoizilor acumulează o concentrație de multe ori mai mare decât plasma seminală, iar zincul este esențial pentru stabilitatea cromatinei și pentru capacitatea cromatinei de a se decondensa la momentul potrivit (Kvist, 1982; Kvist și Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), și a fost sugerat un rol fiziologic pentru zinc ca un conservator pentru un mecanism inerent de desprindere a capului de coadă (Bjorndahl și Kvist, 1982). Cu toate acestea, au existat rapoarte contradictorii cu privire la efectul zincului seminal asupra motilității spermatozoizilor, iar majoritatea studiilor s-au ocupat de evaluări cantitative. Într-un studiu realizat de Lewis-Jones et al. (1996), la 1178 de pacienți trimiși pentru tratament de fertilitate au fost măsurate concentrațiile de zinc și fructoză în plasma seminală, dar pentru zinc nu s-a găsit nicio corelație semnificativă din punct de vedere statistic cu motilitatea. Abou-Shakra et al. (1989) au măsurat mai multe oligoelemente în plasma seminală folosind ICP-MS, dar nu au detectat nicio corelație între concentrația de zinc seminal și densitatea sau motilitatea spermatozoizilor la bărbații normospermi, oligospermi sau azoospermi. Concentrațiile de zinc din studiul lor au fost similare cu nivelurile prezentate în acest studiu. Danscher et al. (1978) au raportat concentrații ridicate de zinc asociate cu o motilitate scăzută a spermatozoizilor, în timp ce alții au raportat că un conținut ridicat de zinc în plasma seminală este asociat cu un grad ridicat de motilitate a celulelor spermatice (Stankovic și Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

În acest studiu ne-am ocupat atât de evaluările cantitative ale zincului total, cât și de determinarea calitativă a localizării ionilor de zinc în celulele spermatice și în lichidul seminal. Deși nu au fost detectate diferențe în conținutul de ioni de zinc al spermatozoizilor la nivel ultrastructural (figura 2A) între acele probe cu zinc total ridicat sau scăzut, caracteristicile observate la nivel de microscopie optică (figura 1) ar putea reflecta o relație între cantitatea totală de zinc și ionii liberi de zinc din plasma seminală. În studii recente, Lewis-Jones et al. (1996) și Carpino et al. (1998) au concluzionat că zincul seminal total este un marker nesigur al activității spermatogenetice și sugerează că ionii de zinc biodisponibil legați de proteine veziculare cu greutate moleculară mare reprezintă un indice mai bun. Metoda AMG prezentată aici demonstrează zincul chelabil, adică ionii de zinc din plasmă sau zincul slab legat de macromolecule. Zincul legat ferm de proteine nu va fi detectat de AMG și nu poate fi chelat. Suntem de acord cu studiile menționate că zincul biodisponibil (deci chelabil) este cel care exercită funcții asupra celulelor spermatozoizilor, inclusiv asupra motilității. Acest studiu indică faptul că concentrațiile de zinc total și de zinc chelatabil sunt legate. Sunt necesare studii suplimentare, iar analiza computerizată a imaginilor, de exemplu a preparatelor AMG, ar putea fi un instrument important.

În contrast cu efectele zincului, concentrația mare de magneziu în sine nu pare să aibă niciun efect inhibitor asupra motilității spermatozoizilor. S-a constatat un efect negativ asupra LIN, dar acesta nu a fost suficient de mare pentru a avea vreun impact asupra celorlalți parametri CASA. S-a raportat că plasma seminală umană conține granule secretorii și vezicule de origine prostatică care ar putea avea un efect de reglementare asupra motilității spermatozoizilor prin modularea concentrației de cationi esențiali din mediul lor (Stegmayr et al., 1982). Membranele acestor organite conțin ATPaze dependente de Mg2+ și Ca2+, inhibate competitiv de Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). O corelație pozitivă ridicată între zinc și magneziu în plasma seminală a fost raportată anterior (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), iar în acest studiu au fost găsite intercorelații puternice similare între toți cei trei cationi (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Calciul este important pentru fiziologia spermatozoizilor, inclusiv pentru motilitate (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987), metabolismul (Peterson și Freund, 1976), reacția acrozomului și fertilizarea (Yanagimachi și Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Rolul calciului seminal în motilitatea spermatozoizilor nu este, totuși, pe deplin înțeles. Thomas și Meizel (1988) au constatat că chelarea ionilor de calciu extracelular cu EGTA inhibă reacția acrozomului, dar, în același timp, nu are niciun efect asupra motilității. Adăugarea ionoforului ionomicină, care induce reacția acrozomică a cationilor divalenți, nu a avut niciun efect asupra motilității, dar a crescut semnificativ numărul spermatozoizilor care reacționează la acrozom. Magnus et al. (1990) nu au găsit nicio asociere între concentrațiile de calciu ionizat și proporția de spermatozoizi care prezintă o mișcare progresivă. Arver și Sjöberg (1982) au raportat că un nivel scăzut de calciu ionizat este asociat cu un număr mai mare și mai bun de spermatozoizi cu mobilitate progresivă. Prien și colab. (1990) au comparat motilitatea, viteza și mișcarea progresivă a spermatozoizilor cu calciul total și ionizat la pacienții cu motilitate normală (>60%) și scăzută (<60%) a spermatozoizilor. Nu s-a constatat nicio diferență în ceea ce privește calciul total, dar s-a constatat o scădere semnificativă din punct de vedere statistic a calciului ionizat seminal la acei bărbați cu motilitate scăzută. În acest studiu a fost măsurat calciul total, dar nu se cunoaște capacitatea de fixare a calciului în plasma seminală. În ceea ce privește calciul, nu a fost detectat niciun impact asupra concentrației motile, iar corelațiile cu parametrii CASA au fost mai slabe decât cele pentru zinc (tabelul II). Atât VSL, cât și LIN au prezentat corelații semnificative inverse cu concentrația totală de calciu (P = 0,02 pentru ambele), în timp ce VCL nu a fost afectată. Dar adăugarea concentrației de zinc într-o analiză de regresie multiplă a eliminat efectele concentrației totale de calciu asupra motilității. Acest lucru este în concordanță cu studiul menționat anterior al lui Prien et al. (1990). În acest studiu, probele cu un raport zinc:calciu scăzut au prezentat valori CASA (VSL, LIN și STR) mai bune din punct de vedere statistic în comparație cu cele cu un raport ridicat. Acest lucru se datorează în principal diferențelor în concentrația de zinc.

Precizia determinărilor de zinc, magneziu și calciu în acest studiu a fost relativ slabă, cu coeficienți de variație de 18, 32 și, respectiv, 17%. Motivul este probabil neomogenitatea probelor, care, în combinație cu volumele mici de probă (20 μl), poate că a afectat precizia. În ciuda impreciziei mari, variația generată în determinările de zinc și magneziu a fost minoră în comparație cu intervalul mare de concentrații din probe.

A fost demonstrat anterior că chelarea ionilor de zinc afectează motilitatea spermatozoizilor la om (Danscher și Rebbe, 1974), șobolan și câine (Saito și colab., 1967; Stoltenberg și colab., 1997). În prezent se efectuează studii cu chelarea intra- și extracelulară a ionilor de zinc, ceea ce ar putea dezvălui importanța localizării ionilor de zinc în lichidul seminal și în celula spermei.

.