3.1 Enzimas endógenas de los peces
Como se ha comentado anteriormente, se encuentran varias enzimas proteolíticas en las vísceras, el tracto digestivo y el tejido muscular de los peces.
Las principales proteinasas endógenas en las anchoas fueron la proteinasa tipo tripsina, la pepsina, la quimotripsina, la elastasa y la aminopeptidasa (Martínez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Las enzimas digestivas tripsina, quimotripsina y pepsina se consideran las tres enzimas más importantes en comparación con otras (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). La pepsina suele encontrarse en el estómago de los peces y es una de las principales enzimas de los jugos digestivos (de la Parra et al., 2007). La tripsina está presente en las vísceras, los ciegos pilóricos y el bazo (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). El hepatopáncreas de los órganos digestivos de los peces y mariscos contiene actividades de peptidasa y proteinasa, como la aminopeptidasa, las proteasas gelatinolíticas, la tripsina y la quimotripsina, y las proteasas colagenolíticas (Sriket, 2014).
Se comprobó que la mayor parte de las actividades de lipólisis y proteólisis en la elaboración de la peda se registraron en el intestino, especialmente al principio del proceso de fermentación; sin embargo, las actividades disminuyeron rápidamente durante el proceso (Irianto, 1990). Teniendo en cuenta que las enzimas se encuentran en las vísceras y el tracto digestivo, la evisceración desempeña un papel importante en la determinación de la tasa y el tipo de degradación enzimática que se produce. Los productos de pescado fermentado elaborados con el pescado entero tendrán características diferentes a los fabricados con pescado descabezado y eviscerado (Wheaton & Lawson, 1985). La actividad enzimática de la mayoría de las enzimas viscerales y del tracto digestivo de los peces tuvo la mayor actividad a valores de pH casi neutros (Bougatef et al., 2007; Munilla-Morán & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, García-Carreño y Toro (2004) aislaron una enzima proteolítica ácida, que pertenece a la clase de las proteasas aspárticas de las vísceras de las sardinas. La enzima es similar a la pepsina II de otras especies de peces y es estable a pH 3-6 y 45°C.
Los ciegos pilóricos representan los órganos que son la mayor fuente de proteinasas alcalinas. Una enzima similar a la tripsina obtenida de los ciegos pilóricos del bacalao (G. morhua) tenía un punto isoeléctrico de 5,30 y 5,89 y era muy similar en la composición de aminoácidos a la tripsina bovina, pero difería en tener una mayor cantidad relativa de aminoácidos ácidos y una menor cantidad de aminoácidos básicos. La enzima también hidrolizó sustratos de proteína de pescado (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Se aislaron tres proteinasas alcalinas y dos proteinasas ácidas de la sardina. Cada una de las proteinasas alcalinas hidrolizó la caseína más rápidamente que otras proteínas. Una de las principales proteinasas alcalinas (III) hidrolizó las proteínas sarcoplásmicas de la sardina cinco veces más rápido que otras proteinasas alcalinas. Cada una de las dos proteinasas ácidas hidrolizó la hemoglobina y la mioglobina más rápidamente que las otras proteínas. Tras la preincubación con un 25% de NaCl, una proteinasa alcalina (III) y una proteinasa ácida (II) fueron estables, mientras que las otras proteinasas se volvieron inestables. Las dos proteinasas, la proteinasa alcalina III y la proteinasa ácida II, también fueron estables durante 3 meses después del inicio de la producción de salsa de pescado. La actividad proteolítica de cada una de las proteinasas alcalinas y ácidas se vio fuertemente inhibida por más del 15% de NaCl; sin embargo, se observó una inhibición mínima cuando se utilizaron proteínas del músculo de la sardina como sustrato (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Dos aminopeptidasas (I y II) se extrajeron de órganos internos desgrasados de sardina y se purificaron mediante cromatografía de celulosa DEAE, filtración en gel sobre Sephadex G-200 y enfoque isoeléctrico. Las preparaciones finales de las enzimas I y II se consideraron casi homogéneas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los pesos moleculares de las enzimas I y II se determinaron por filtración en gel como 370.000 y 320.000, respectivamente. Los puntos isoeléctricos fueron 4,1 (I) y 4,8 (II), respectivamente. Ambas enzimas fueron inhibidas por el EDTA y activadas por el Co++. La bestatina podía inhibir la enzima I pero no la II. Las enzimas I y II hidrolizaron rápidamente no sólo sustratos sintéticos que contenían alanina o leucina, sino también di-, tri- y tetra-alanina. En base a todas estas características, las aminopeptidasas de sardina se parecen a la alanina aminopeptidasa humana. La enzima I retuvo más del 70% de su actividad original en un 15% de NaCl, lo que sugiere que la enzima participa en la hidrolización de proteínas y péptidos de pescado durante la producción de salsa de pescado (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Se compararon las actividades de las proteinasas alcalinas y ácidas con la tripsina y la pepsina bovina y se demostró que, al igual que la tripsina bovina, la proteinasa alcalina del ciego pilórico de las sardinas hidrolizaba la caseína con mayor eficacia que otros sustratos proteicos (Noda et al., 1982).
Las enzimas del tejido muscular, en particular las catepsinas, peptidasas, transaminasas, amidasas, descarboxilasas de aminoácidos, deshidrogenasas glutámicas y enzimas relacionadas, se encuentran en el tejido muscular de los peces (Chaveesuk, 1991), y estas enzimas, en particular la tripsina, la quimotripsina y la catepsina, participan en la hidrólisis de proteínas durante la fermentación de la salsa de pescado (Fernandes, 2016). Las enzimas del tejido muscular se localizan principalmente en las células. Por otro lado, las enzimas digestivas son de secreción exocelular. Aunque algunos estudios mostraron que las enzimas del tejido muscular tienen una actividad óptima a pH neutro, la mayoría de los informes informan que los valores de pH bajos aceleran las actividades de las enzimas del tejido muscular. La mayoría de los productos pesqueros fermentados se procesan a un pH superior a 4, excepto el ensilado de pescado y algunos productos pesqueros fermentados. En consecuencia, la mayoría de las enzimas del tejido muscular no se encuentran en condiciones óptimas de pH (Mackie et al., 1971).
La caracterización parcial de las catepsinas B del músculo del jurel indicó características similares con otras catepsinas BS. El pH óptimo de la catepsina fue de 5 con una temperatura óptima de 50°C. La actividad fue inhibida por E-64, CA-074 y quimostatina (Yoshida et al., 2015).
La máxima actividad enzimática puede lograrse utilizando peces enteros, incluyendo cabezas y vísceras. Por el contrario, se producirá una actividad enzimática mínima cuando se utilice pescado descabezado y eviscerado para producir productos de pescado fermentados. Mientras tanto, pueden obtenerse actividades enzimáticas intermedias si se retiran las vísceras en cualquier momento después de la captura del pescado para permitir cierta difusión de las enzimas viscerales en los tejidos (Owens & Mendoza, 1985).
En el pescado salado, la maduración se describe mediante tres hipótesis. Estas son (1) la teoría microbiológica, (2) la teoría autolítica, y (3) la teoría de las enzimas. En la teoría microbiológica, los microorganismos producen las enzimas activas esenciales, y estas enzimas penetran en la carne y contribuyen al proceso de maduración. La teoría autolítica describe que la maduración es el resultado de la actividad de las enzimas de los músculos u otros tejidos, o del tracto gastrointestinal. Por último, la teoría enzimática explica que la maduración del pescado salado tiene lugar bajo la influencia de ciertas enzimas, a saber, las contenidas en el tejido muscular, las de los órganos del cuerpo intestinal del pescado, junto con las producidas por los microorganismos (Mackie et al., 1971).
En la maduración de las anchoas, la máxima actividad autolítica de la anchoa india (Stolephorus indicus) se encontró a 60°C. La actividad autolítica disminuyó al aumentar la concentración de NaCl. El extracto crudo mostró un pH óptimo entre 8,5 y 9,5. Las proteinasas tipo tripsina fueron las predominantes en el extracto crudo. Las proteinasas de la anchoa india podrían participar en la hidrólisis de proteínas durante la fermentación de la salsa de pescado. Por lo tanto, la incubación de la anchoa india a 60°C y en NaCl al 10% durante un período de tiempo antes de la salazón completa al 25% de NaCl podría ser una forma eficaz de acelerar el proceso de fermentación de la salsa de pescado (Siringan et al., 2006).