- Abstract
- 1. Introducción
- 2. Materiales y métodos
- 2.1. Preparación de extractos de callo de Safed Musli
- 2.2. Biosíntesis de AgNPs
- 2.3. Caracterización de las AgNPs
- 2.3.1. Análisis espectral UV-Visible
- 2.3.2. Análisis de difracción de rayos X (DRX)
- 2.3.3. Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)
- 2.3.4. El análisis FTIR de las AgNP sintetizadas biogenéticamente se realizó utilizando un espectro FTIR de Perkin Elmer con pellet de KBr y un instrumento FTIR Shimazdu IR Prestige-21 con modo de reflexión difusa (DRS-8000). Todas las mediciones se realizaron en el rango de 400-4000 cm-1. 2.4. Evaluación de la actividad antibacteriana
- 2.5. Evaluación de la citotoxicidad contra la línea celular de cáncer de colon HT-29
- 2,6. Análisis estadístico
- 3. Resultados y discusión
- 3.1. La formación de callos y la síntesis de AgNPs
- 3.2. Caracterización de las AgNPs
- 3.2.1. El uso de espectroscopia UV-visible, XRD, AFM, y análisis FTIR ha proporcionado la información relacionada con el tamaño, la forma, la dispersión y el área superficial de las AgNPs mediadas por el extracto de callo. El espectro UV mostró la presencia de un pico de absorbancia agudo en torno a 450 nm, lo que sugiere la presencia de AgNPs (Figura 3). Según informes anteriores, la banda de absorción UV-visible entre 425 y 460 nm indica la resonancia de plasmón superficial (SPR) de las AgNP. Este pico de SPR, junto con los agentes biorreductores del extracto de callo, puede estar implicado en el recubrimiento para formar y estabilizar las AgNP. La presencia de un pico amplio podría correlacionarse con la naturaleza polidispersa de las AgNPs con forma esférica. Figura 3 Espectroscopia de absorción UV-visible que muestra el pico SPR característico de las AgNPs. 3.2.2. Análisis XRD
- 3.2.3. Se llevó a cabo un análisis de AFM para registrar las características topológicas de las AgNP biosintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli. El resultado reveló evidentemente que la existencia de AgNPs de forma esférica está uniformemente dispersa (Figura 5). El tamaño de las AgNP oscilaba entre 35,1 y 168,0 nm con un tamaño medio de 52,0 nm. Las AgNP biosintetizadas tenían una rugosidad de 7,9 nm y una rugosidad media cuadrática de 14,6 nm (Figuras 5(a) y 5(b)). Estas observaciones se confirman con las AgNP de forma esférica y nanorreguladas previamente reportadas, biosintetizadas a partir de diferentes especies de plantas, incluyendo Leptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa y Coptidis rhizoma . (a) (b) (a)(b) Figura 5 Imágenes AFM de las AgNPs biosintetizadas por el extracto de callo de Safed musli.
- 3.2.4. Análisis FTIR
- 3.3. Evaluación de la actividad antibacteriana
- 3.4. AgNPs contra células cancerosas
- 4. Conclusión
- Disponibilidad de datos
- Conflictos de intereses
Abstract
Con el avance de la nanobiotecnología, los enfoques ecológicos de la biosíntesis de nanomateriales de plata (AgNP) mediada por plantas se han vuelto más atractivos para aplicaciones biomédicas. El presente estudio es un informe sobre la biosíntesis de AgNPs utilizando el extracto de callo de Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) como una nueva fuente de agente reductor. La solución de AgNO3 mezclada con el extracto metanólico del callo mostró un cambio de color de amarillo a marrón debido a la reacción de biorreducción. Además, las AgNP se caracterizaron mediante espectrofotometría UV-visible, difracción de rayos X (XRD), microscopía de fuerza atómica (AFM) y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). El espectro UV-vis reveló la propiedad de resonancia plasmónica superficial de las AgNP en torno a los 450 nm. El patrón XRD con picos típicos indicó la naturaleza cúbica centrada en la cara de la plata. El análisis AFM confirmó la existencia de AgNPs de forma esférica y bien dispersas con un tamaño medio de 52,0 nm. Además, el análisis FTIR confirmó la participación de diferentes fitoconstituyentes del extracto de callo en el proceso de biorreducción para formar nanopartículas. Las AgNP fueron más eficaces en la inhibición de los microbios patógenos probados, a saber, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Escherichia coli resistente a la meticilina, Staphylococcus aureus y Candida albicans, en comparación con el extracto de callo. El ensayo con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) confirmó la propiedad citotóxica de las AgNP contra la línea celular de adenocarcinoma de colon humano (HT-29) de forma dependiente de la dosis. A concentraciones más altas de 500 μg/mL de AgNPs, se observó que la viabilidad celular era sólo del 7% después de 24 horas con un valor IC50 de 254 μg/mL. Por lo tanto, estas AgNPs avalan claramente el múltiple potencial para ser utilizadas en diversas aplicaciones biomédicas en un futuro próximo.
1. Introducción
Como campo científico emergente en el mundo moderno, la nanotecnología ha beneficiado enormemente a los seres humanos. La nanotecnología tiene como objetivo producir y utilizar materiales de tamaño nanométrico que miden entre 1 y 100 nm . Las características únicas de los materiales de tamaño nanométrico los hacen más atractivos para su aplicación en diversos campos, especialmente para la administración de moléculas de medicamentos, el análisis de imágenes, como biomarcador, la biodetección de macromoléculas o patógenos, etc. . Se están utilizando varios tipos de metales para la síntesis de nanomateriales para aplicaciones biomédicas específicas. Entre ellos se encuentran la plata (Ag), el oro (Au), el dióxido de titanio (TiO2), el óxido de zinc (ZnO), el óxido de cobre (CuO), el óxido de magnesio (MgO), el óxido de calcio (CaO) y el sílice (Si). Estas nanoestructuras presentan propiedades fisicoquímicas y biológicas únicas, como resistencia, plasticidad, durabilidad y funciones. Por ello, se aplican ampliamente en diferentes áreas, como la electrónica, la biomedicina y la bioingeniería. Como la plata posee actividad antimicrobiana, se está utilizando ampliamente en la preparación de diversos agentes antimicrobianos durante los últimos años. Hoy en día, la plata se utiliza para sintetizar nanopartículas de plata (AgNPs) para diferentes aplicaciones en los campos de la medicina, la alimentación, el cuidado de la salud, etc. Esto se debe a que las AgNPs con una mayor relación superficie-volumen poseen propiedades biológicas, eléctricas, térmicas y ópticas únicas.
Hay varios enfoques para sintetizar AgNPs, incluyendo métodos químicos, físicos y biológicos . Sin embargo, el método preferido es el uso de la ruta biológica que implica compuestos de plantas o extractos de plantas, microbios, o sus productos. Esto se debe principalmente a los aspectos de seguridad, rentabilidad y respeto al medio ambiente. Por otro lado, los métodos químicos y físicos implican productos químicos tóxicos, mucha energía, gran presión y alta temperatura. Las AgNP se produjeron sucesivamente utilizando diferentes extractos de plantas, como Leptadenia reticulata , Cassia didymobotrya , Andrographis paniculata , Prunus japonica , Talinum triangulare , Euphorbia antiquorum , Thymbra spicata , y Cleome viscosa . Recientemente, se están sintetizando AgNPs a partir del callo de la planta como una nueva fuente. Por ejemplo, los callos inducidos de Catharanthus roseus, Sesuvium portulacastrum, Taxus yunnanensis, Centella asiatica, Cucurbita maxima, etc., se utilizan para la biosíntesis de AgNPs . Ventajosamente, los cultivos de callos mitigan los problemas de escasez de fuentes de plantas silvestres. Además, los extractos de callo son más eficientes en la producción de AgNPs más distintas y dispersas en comparación con las biosintetizadas utilizando extractos de hojas con mayores bioactividades.
Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) es una valiosa planta medicinal, que tiene copiosos componentes bioactivos, como fenoles, saponinas, flavonoides, alcaloides, taninos, esteroides, triterpenoides y vitaminas. La planta es eficaz para curar la leucorrea crónica, la diabetes, la artritis, la hipertensión y el retraso de la menopausia. Para superar los problemas del cultivo de Safed musli en el campo, se han adoptado enfoques de cultivo de tejidos vegetales para obtener sus compuestos bioactivos. El cultivo de callos de Safed musli como fuente fiable de metabolitos secundarios de las plantas ha sido demostrado anteriormente por Charl et al. Además, también han informado de las actividades antimicrobianas y antioxidantes del extracto de callo de Safed musli. Sin embargo, hasta la fecha no hay ningún informe sobre la biosíntesis de AgNP utilizando la planta Safed musli o su callo. Por lo tanto, el presente estudio informa de un método biológico de síntesis de AgNPs utilizando extractos de callo de Safed musli para evaluar sus propiedades biológicas.
2. Materiales y métodos
2.1. Preparación de extractos de callo de Safed Musli
Para iniciar los cultivos de callo de Safed musli, se siguió el método explicado por Nakasha et al. Brevemente, las yemas de Safed musli se inocularon en un medio sólido de Murashige y Skoog que contenía 5 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y se cultivaron durante 4 semanas y luego se cosecharon. Para preparar el extracto de callo, se molieron 20 g de peso fresco de callo junto con 100 mL de metanol y se hirvieron durante unos 5 minutos. Utilizando el papel de filtro Whatman nº 1, se filtró el extracto y se mantuvo a 4°C. El extracto se utilizó para la preparación de AgNP en una semana.
2.2. Biosíntesis de AgNPs
Aproximadamente 10 mL de extractos de callo se desafiaron con 90 mL de solución de AgNO3 (nitrato de plata) 1 mM contenida en un matraz Erlenmeyer (250 mL). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente en un agitador (150 rpm) sin luz. El cambio de color se registró periódicamente hasta 5 horas, y las AgNP se almacenaron a temperatura ambiente durante 3 meses para comprobar su estabilidad. La mezcla de reacción se centrifugó a 20.000 rpm durante 15 minutos para concentrar las AgNPs sintetizadas biogénicamente para su posterior caracterización.
2.3. Caracterización de las AgNPs
2.3.1. Análisis espectral UV-Visible
El cambio en la formación de color en la mezcla de reacción se monitorizó visualmente. Se recogieron periódicamente unos 2 mL de la solución después de 1, 3 y 5 horas de incubación, y se midió la reducción de los iones de plata en el espectro UV-visible de 300-600 nm utilizando un espectrofotómetro (ELICO, India).
2.3.2. Análisis de difracción de rayos X (DRX)
En el portaobjetos de vidrio, se añadió una sola gota de solución de AgNP y se recubrió. Posteriormente se analizó para registrar la naturaleza cristalina de las nanopartículas biosintetizadas mediante el uso de un difractómetro de rayos X (XRD), modelo XRD-6000, Shimadzu, Japón, con 40 kV y 30 mA con radiación Cu ka a 2θ ángel.
2.3.3. Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)
Usando AFM (A.P.E. Research A100, Italia), se caracterizaron las AgNPs para observar sus características morfológicas. En primer lugar, la solución que contenía las AgNP se sonicó a temperatura ambiente durante 15 minutos utilizando un ultrasonido. Posteriormente, la solución de AgNP se secó para formar una capa fina sobre un portaobjetos de vidrio con base de mica, y ésta se utilizó para observar bajo AFM.
2.3.4. El análisis FTIR de las AgNP sintetizadas biogenéticamente se realizó utilizando un espectro FTIR de Perkin Elmer con pellet de KBr y un instrumento FTIR Shimazdu IR Prestige-21 con modo de reflexión difusa (DRS-8000). Todas las mediciones se realizaron en el rango de 400-4000 cm-1.
2.4. Evaluación de la actividad antibacteriana
Se evaluó la actividad antimicrobiana de las AgNP biosintetizadas mediante un método de difusión en disco frente a cepas bacterianas Gram-positivas patógenas humanas comunes, Bacillus subtilis B29 (ATCC 29737), Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) (ATCC700698) (Gram-positivo), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), y Escherichia coli E266 (Gram-negativo), y una especie fúngica, Candida albicans 90028. Todas las cepas microbianas se obtuvieron del Laboratorio de Biomedicina Molecular, Instituto de Biociencia, UPM, Serdang, Malasia. Todas las cepas bacterianas se mantuvieron en el medio Agar Mueller-Hinton (MHA), mientras que la C. albicans 90028 se cultivó en el medio Agar Patata Dextrosa (PDA). Para evaluar las actividades antibacterianas, se empleó el método de ensayo de difusión en disco con pequeñas modificaciones. Brevemente, el cultivo puro de cada microbio se extendió uniformemente en las placas de Petri separadas utilizando hisopos de algodón estériles. En el medio de cultivo se colocaron discos estériles (de 6 mm de diámetro) precintados con diferentes concentraciones (100, 200 y 300 μg/mL) de AgNPs y del extracto metanólico de la hoja. El dimetilsulfóxido (DMSO) (10 μg/μL) y la gentamicina (10 μg/disco) se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente, contra todos los microbios probados. Cada tratamiento se replicó 5 veces, y el experimento se repitió dos veces. Todas las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas, y se registró la aparición de la zona de inhibición (mm) con la ayuda de una regla.
2.5. Evaluación de la citotoxicidad contra la línea celular de cáncer de colon HT-29
Evaluamos el efecto citotóxico de las AgNP micógenas sobre la línea celular de cáncer de colon HT-29 como se informó anteriormente . En resumen, las células se cultivaron en el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contenido con penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 g/mL), L-glutamina (2 mM) y suero bovino fetal (10%). Se utilizaron aproximadamente 5 × 104 células para la inoculación en un pozo de placas de 96 pocillos. Se utilizó una incubadora de CO2 ajustada a 37°C para incubar las células durante 48 horas. Para estudiar la citotoxicidad, las células se trataron con las AgNP biosintetizadas (10, 20, 40, 80, 120 y 160 μg/mL) y se incubaron durante 48 horas para evaluar la capacidad de supervivencia de las células mediante el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). En primer lugar, se preparó una solución fresca de MTT (5 mg/mL) y se dispensaron unos 10 mL en cada pocillo. Además, se mantuvo para la incubación hasta 4 horas en las mismas condiciones. Utilizando un lector de placas ELISA multipozo, se documentó la absorbancia a 570 nm. La absorbancia obtenida se transformó en porcentaje de viabilidad celular mediante la siguiente fórmula:
2,6. Análisis estadístico
Todos los experimentos se replicaron tres veces y se repitieron tres veces. Los datos obtenidos de cada experimento se representaron como desviación (SD).
3. Resultados y discusión
3.1. La formación de callos y la síntesis de AgNPs
La síntesis de AgNPs a través de la ruta biológica ha ganado más importancia en los últimos tiempos debido a que el método biológico produce AgNPs estables y uniformes con una importancia farmacológica superior . En el presente estudio se utilizó el extracto de callo de Safed musli como sustrato para sintetizar AgNPs a temperatura ambiente. En este estudio, se cosecharon callos friables de color amarillo formados después de 2 meses (Figura 1).
Aparentemente, los callos de Safed musli en esta etapa se consideran maduros y bien desarrollados para secretar metabolitos secundarios de la planta. Por lo tanto, los callos cosechados después de 2 meses se utilizaron en el proceso de síntesis de AgNPs . En general, la producción y las características de las nanopartículas varían en función de los compuestos bioactivos presentes en los extractos solventes de una especie vegetal. Cuando la solución de AgNO3 fue desafiada con el extracto metanólico de callo de Safed musli, hubo un cambio en el color de amarillo a marrón claro debido a la reacción de biorreducción (Figura 2). Esto sugiere claramente la biosíntesis de las AgNPs, que se correlaciona con la excitación de las vibraciones de resonancia del plasmón superficial en las AgNPs . El cambio de color se observó inmediatamente en una hora, y la intensidad del color aumentó con el tiempo de incubación hasta 5 horas. Sin embargo, más de 5 horas de incubación no mostraron ningún cambio observable en el color. La intensidad del color aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de incubación y siguió siendo la más alta después de 5 horas de incubación. Hasta ahora, los mecanismos exactos implicados en la biosíntesis de AgNPs a partir de extractos de plantas no se conocen con claridad. Sin embargo, se han propuesto algunos mecanismos posibles que podrían estar implicados en la biosíntesis. Así, las enzimas celulares junto con la presencia de diversas clases de fitocompuestos, como fenólicos, flavonoides, fitoesteroles, terpenoides, ácidos orgánicos, alcaloides y alcoholes, presentes en los extractos vegetales, podrían reducir eficazmente la formación de AgNPs a partir de iones de plata. Anteriormente, los investigadores han informado de que la duración de la incubación para completar la biorreducción de los iones de plata para formar AgNPs varía de una especie vegetal a otra debido a las diferencias en la aparición de fitoconstituyentes en los extractos de plantas .
3.2. Caracterización de las AgNPs
3.2.1. El uso de espectroscopia UV-visible, XRD, AFM, y análisis FTIR ha proporcionado la información relacionada con el tamaño, la forma, la dispersión y el área superficial de las AgNPs mediadas por el extracto de callo. El espectro UV mostró la presencia de un pico de absorbancia agudo en torno a 450 nm, lo que sugiere la presencia de AgNPs (Figura 3). Según informes anteriores, la banda de absorción UV-visible entre 425 y 460 nm indica la resonancia de plasmón superficial (SPR) de las AgNP. Este pico de SPR, junto con los agentes biorreductores del extracto de callo, puede estar implicado en el recubrimiento para formar y estabilizar las AgNP. La presencia de un pico amplio podría correlacionarse con la naturaleza polidispersa de las AgNPs con forma esférica.
Figura 3
Espectroscopia de absorción UV-visible que muestra el pico SPR característico de las AgNPs.
3.2.2. Análisis XRD
La observación de los picos de difracción del análisis XRD proporciona los detalles sobre la naturaleza cristalina y la composición química de las AgNPs biosintetizadas. El resultado del patrón de DRX de las AgNP sintetizadas utilizando el extracto de callo de Safed musli se ilustra en la figura 4. Se registraron las intensidades difractadas de 20° a 70°. Los picos observados a 2θ de 38,34°, 44,54° y 64,6° corresponden a los planos (111), (200) y (220), respectivamente, de la estructura cúbica centrada en la cara de la plata. Estos resultados son similares al registro del Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS nº 04-0783). Asimismo, otros picos menores observados podrían estar correlacionados con los compuestos orgánicos cristalinos que se adsorben en la superficie de la AgNP. También se observaron patrones de difracción similares en hallazgos anteriores relacionados con AgNPs sintetizadas a partir de fuentes vegetales.
Figura 4
Patrón de DRX de AgNPs biosintetizadas utilizando extracto de callo de Safed musli.
3.2.3. Se llevó a cabo un análisis de AFM para registrar las características topológicas de las AgNP biosintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli. El resultado reveló evidentemente que la existencia de AgNPs de forma esférica está uniformemente dispersa (Figura 5). El tamaño de las AgNP oscilaba entre 35,1 y 168,0 nm con un tamaño medio de 52,0 nm. Las AgNP biosintetizadas tenían una rugosidad de 7,9 nm y una rugosidad media cuadrática de 14,6 nm (Figuras 5(a) y 5(b)). Estas observaciones se confirman con las AgNP de forma esférica y nanorreguladas previamente reportadas, biosintetizadas a partir de diferentes especies de plantas, incluyendo Leptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa y Coptidis rhizoma .
(a)
(b)
(a)
(b)
Figura 5
Imágenes AFM de las AgNPs biosintetizadas por el extracto de callo de Safed musli.
3.2.4. Análisis FTIR
La probable interacción de las AgNP biosintetizadas y los diferentes fitocompuestos presentes en el extracto de callo de Safed musli se determinó mediante análisis FTIR. Está acreditado que estos fitoconstituyentes funcionan como agentes reductores y estabilizadores durante la biosíntesis de las AgNP. La figura 6 muestra los datos espectrales FTIR de las AgNP biosintetizadas con 14 picos distintos en el rango de la región de 4000-500 cm-1. Un pico amplio a 3437,86 cm-1 corresponde a las vibraciones de estiramiento de los grupos -O-H y -N-H. Asimismo, el pico a 2920,59 cm-1 es el resultado de los grupos -C-H. Las bandas a 1623,72 cm-1 y 1376 cm-1 podrían deberse a las vibraciones de estiramiento de los grupos C=C y a la presencia de grupos amina tipo C-N o fenol tipo C-O, respectivamente. El número de onda 1382,41 podría asignarse al grupo -CH2. El pico de 1019,38 se debe al estiramiento de los grupos C=O. Tres bandas débiles a 828,4, 671,13 y 615,95 cm-1 corresponden a vibraciones de flexión de los grupos -O-H y C-H. Investigadores anteriores realizaron observaciones similares en otras AgNP de origen vegetal. Además, estos picos de absorbencia pueden ser atribuidos a numerosos compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de callo de Safed musli. En apoyo de esto, un estudio anterior de Charl et al. ha confirmado la presencia de diferentes fitoconstituyentes utilizando el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas. En general, los datos FTIR muestran la multifuncionalidad del extracto de callo de Safed musli en el proceso de biorreducción, así como para estabilizar las AgNP.
Figura 6
Datos espectrales FTIR de las AgNPs producidas por el extracto de callo de Safed musli.
3.3. Evaluación de la actividad antibacteriana
Las AgNPs presentan una actividad antimicrobiana de amplio espectro y, por lo tanto, son ampliamente utilizadas en aplicaciones clínicas . Sin embargo, su uso como antimicrobianos será eficaz y puede aplicarse sólo después de abordar los problemas de sus efectos secundarios adversos . Por lo tanto, evaluamos las actividades antimicrobianas de las AgNP biosintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli contra los patógenos humanos. Se observó que las AgNPs inhibieron eficazmente todas las cepas bacterianas ensayadas de forma dependiente de la dosis (Tabla 1). Curiosamente, las AgNP mostraron una mayor zona de inhibición en comparación con el extracto de callo. La mayor inhibición de las AgNP se observó contra C. albicans ( mm), seguida de B. subtilis ( mm) y E. coli ( mm) a una concentración de 300 μg/mL. Sin embargo, todos los microbios fueron inhibidos por las AgNPs a la concentración de 300 μg/mL. La máxima actividad inhibitoria se observó contra B. subtilis () seguido de C. albicans () y E. coli () a la concentración de 300 mg/mL de AgNPs. Anteriormente, los investigadores han sugerido algunos posibles mecanismos de acción antimicrobiana de las AgNP de origen vegetal. Así, las AgNP desnaturalizan la pared celular de los microbios, desestabilizan la membrana externa, bloquean la respiración celular, inhiben la biosíntesis e interrumpen la fuerza motriz de protones. Además, la mayor relación superficie-volumen de las AgNP es responsable de la actividad antimicrobiana. Los resultados del presente estudio indican claramente que las AgNPs sintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli podrían utilizarse como agentes antibacterianos para tratar muchas enfermedades humanas.
Concentración (μg/mL)
Zona de inhibición (mm)
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Candida albicans
B29
(MRSA)
ATCC 15442
E266
90028
Extracto de callo de Indias
.
100
200
300
AgNPs
100
.
200
300
El experimento incluyó DMSO (20 μL) como control negativo, mientras que la estreptomicina (100 mg/mL) para las bacterias y la nistatina (100 mg/mL) para las levaduras sirvieron de control positivo. Cada valor representa la desviación (SD) de 3 réplicas por tratamiento en 3 experimentos repetidos. Nota: “-” representa que no se ha observado ninguna actividad, mientras que “MR” representa la resistencia a la meticilina.
Tabla 1
Actividades antimicrobianas del extracto de callo de Safed musli y de sus AgNPs biosintetizadas contra patógenos humanos.
3.4. AgNPs contra células cancerosas
Además, la actividad de las AgNPs contra la línea celular cancerosa HT-29 se llevó a cabo mediante el ensayo MTT. Los resultados del estudio se representan en la Figura 7. El porcentaje de viabilidad celular disminuyó con el aumento de las concentraciones de AgNPs de 0 a 500 μg/mL. Evidentemente, esto sugiere que las AgNPs presentan una actividad inhibidora de las células dependiente de la dosis. Además, el aumento del tiempo de exposición de 24 a 48 horas disminuyó el porcentaje de viabilidad celular. Después de 24 horas, los tratamientos de control registraron un 100% de viabilidad celular, mientras que sólo el 7% de las células sobrevivieron a 500 μg/mL de AgNPs, que disminuyó aún más al 2% después de 72 horas de tiempo de incubación. Esto significa un alto efecto de toxicidad de las AgNPs. Aunque las AgNP biosintetizadas muestran una menor toxicidad a dosis bajas, inducen un efecto letal muy elevado a dosis más altas. Del mismo modo, investigadores anteriores han documentado la potencial acción inhibidora de las células de las AgNPs de origen vegetal de forma dependiente de la dosis. Se calculó que el valor IC50 de las AgNPs era de 254, 216 y 174 μg/mL después de 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente, de tratamiento.
Figura 7
Resultados de la citotoxicidad de las AgNPs biosintetizadas utilizando extractos de callo de Safed musli.
En un informe anterior, se afirma que el extracto de callo de Safed musli posee varias clases de fitoquímicos . Así, los grupos funcionales reactivos de los fitocompuestos, como los grupos hidroxilo, carboxilo y amino, se acoplan con los iones de plata para mostrar una mayor citotoxicidad. Asimismo, está demostrado que los iones de plata junto con los grupos funcionales reactivos interactúan vigorosamente con la arquitectura celular para causar daño celular.
Además, los iones de plata poseen una fuerte afinidad hacia los grupos sulfhidrilos de las enzimas esenciales y las bases que contienen fósforo. Por lo tanto, las AgNP interactúan eficazmente con los ácidos nucleicos y causan daños en el ADN a través de la interrupción de la cadena respiratoria mitocondrial, fomentando la formación de especies reactivas de oxígeno, inhibiendo la replicación del ADN y la división celular, promoviendo la apoptosis, etc. . Además, otras características de las AgNP, como la naturaleza nanoregética, la forma esférica y la superficie de las partículas, también contribuyen a las propiedades anticancerígenas. Del mismo modo, se ha informado de que los nanomateriales preparados mediante el uso de diversos materiales a granel han dilucidado sus actividades de inhibición celular contra las células de cáncer de colon. En concreto, la actividad anticancerígena se atribuyó principalmente a la composición química de los extractos vegetales y a las características de las nanopartículas, incluyendo el tamaño y las características morfológicas de las AgNPs.
4. Conclusión
En conclusión, este estudio describe un enfoque eficiente, rentable y respetuoso con el medio ambiente para la biosíntesis de AgNPs utilizando el extracto de callo de Safed musli. Las AgNPs biofabricadas poseen forma esférica con un tamaño de partícula que oscila entre 35,1 y 168,0 nm. El patrón de DRX estableció que las AgNPs se presentan en forma de nanocristales, mientras que la observación por AFM confirmó las formas esféricas de las AgNPs. El espectro FTIR reveló la presencia de fitoquímicos en los extractos de callo y se atribuyen a la biosíntesis y estabilización de las AgNPs. Además, la exhibición de actividad antimicrobiana y anticancerígena por parte de las AgNP biosintetizadas sugiere que podrían utilizarse en la fabricación de nanofármacos para aplicaciones terapéuticas, como agentes antimicrobianos, y para el tratamiento del cáncer de colon. En total, estos hallazgos avalan claramente el múltiple potencial de estas AgNPs fitofabricadas.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen dentro del artículo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.
3.2.2. Análisis XRD
La observación de los picos de difracción del análisis XRD proporciona los detalles sobre la naturaleza cristalina y la composición química de las AgNPs biosintetizadas. El resultado del patrón de DRX de las AgNP sintetizadas utilizando el extracto de callo de Safed musli se ilustra en la figura 4. Se registraron las intensidades difractadas de 20° a 70°. Los picos observados a 2θ de 38,34°, 44,54° y 64,6° corresponden a los planos (111), (200) y (220), respectivamente, de la estructura cúbica centrada en la cara de la plata. Estos resultados son similares al registro del Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS nº 04-0783). Asimismo, otros picos menores observados podrían estar correlacionados con los compuestos orgánicos cristalinos que se adsorben en la superficie de la AgNP. También se observaron patrones de difracción similares en hallazgos anteriores relacionados con AgNPs sintetizadas a partir de fuentes vegetales.
3.2.3. Se llevó a cabo un análisis de AFM para registrar las características topológicas de las AgNP biosintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli. El resultado reveló evidentemente que la existencia de AgNPs de forma esférica está uniformemente dispersa (Figura 5). El tamaño de las AgNP oscilaba entre 35,1 y 168,0 nm con un tamaño medio de 52,0 nm. Las AgNP biosintetizadas tenían una rugosidad de 7,9 nm y una rugosidad media cuadrática de 14,6 nm (Figuras 5(a) y 5(b)). Estas observaciones se confirman con las AgNP de forma esférica y nanorreguladas previamente reportadas, biosintetizadas a partir de diferentes especies de plantas, incluyendo Leptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa y Coptidis rhizoma .
(a)
(b)
(a)
(b)
Figura 5
Imágenes AFM de las AgNPs biosintetizadas por el extracto de callo de Safed musli.
(a)
(b)
(a)
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3.2.4. Análisis FTIR
La probable interacción de las AgNP biosintetizadas y los diferentes fitocompuestos presentes en el extracto de callo de Safed musli se determinó mediante análisis FTIR. Está acreditado que estos fitoconstituyentes funcionan como agentes reductores y estabilizadores durante la biosíntesis de las AgNP. La figura 6 muestra los datos espectrales FTIR de las AgNP biosintetizadas con 14 picos distintos en el rango de la región de 4000-500 cm-1. Un pico amplio a 3437,86 cm-1 corresponde a las vibraciones de estiramiento de los grupos -O-H y -N-H. Asimismo, el pico a 2920,59 cm-1 es el resultado de los grupos -C-H. Las bandas a 1623,72 cm-1 y 1376 cm-1 podrían deberse a las vibraciones de estiramiento de los grupos C=C y a la presencia de grupos amina tipo C-N o fenol tipo C-O, respectivamente. El número de onda 1382,41 podría asignarse al grupo -CH2. El pico de 1019,38 se debe al estiramiento de los grupos C=O. Tres bandas débiles a 828,4, 671,13 y 615,95 cm-1 corresponden a vibraciones de flexión de los grupos -O-H y C-H. Investigadores anteriores realizaron observaciones similares en otras AgNP de origen vegetal. Además, estos picos de absorbencia pueden ser atribuidos a numerosos compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de callo de Safed musli. En apoyo de esto, un estudio anterior de Charl et al. ha confirmado la presencia de diferentes fitoconstituyentes utilizando el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas. En general, los datos FTIR muestran la multifuncionalidad del extracto de callo de Safed musli en el proceso de biorreducción, así como para estabilizar las AgNP.
3.3. Evaluación de la actividad antibacteriana
Las AgNPs presentan una actividad antimicrobiana de amplio espectro y, por lo tanto, son ampliamente utilizadas en aplicaciones clínicas . Sin embargo, su uso como antimicrobianos será eficaz y puede aplicarse sólo después de abordar los problemas de sus efectos secundarios adversos . Por lo tanto, evaluamos las actividades antimicrobianas de las AgNP biosintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli contra los patógenos humanos. Se observó que las AgNPs inhibieron eficazmente todas las cepas bacterianas ensayadas de forma dependiente de la dosis (Tabla 1). Curiosamente, las AgNP mostraron una mayor zona de inhibición en comparación con el extracto de callo. La mayor inhibición de las AgNP se observó contra C. albicans ( mm), seguida de B. subtilis ( mm) y E. coli ( mm) a una concentración de 300 μg/mL. Sin embargo, todos los microbios fueron inhibidos por las AgNPs a la concentración de 300 μg/mL. La máxima actividad inhibitoria se observó contra B. subtilis () seguido de C. albicans () y E. coli () a la concentración de 300 mg/mL de AgNPs. Anteriormente, los investigadores han sugerido algunos posibles mecanismos de acción antimicrobiana de las AgNP de origen vegetal. Así, las AgNP desnaturalizan la pared celular de los microbios, desestabilizan la membrana externa, bloquean la respiración celular, inhiben la biosíntesis e interrumpen la fuerza motriz de protones. Además, la mayor relación superficie-volumen de las AgNP es responsable de la actividad antimicrobiana. Los resultados del presente estudio indican claramente que las AgNPs sintetizadas a partir del extracto de callo de Safed musli podrían utilizarse como agentes antibacterianos para tratar muchas enfermedades humanas.
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El experimento incluyó DMSO (20 μL) como control negativo, mientras que la estreptomicina (100 mg/mL) para las bacterias y la nistatina (100 mg/mL) para las levaduras sirvieron de control positivo. Cada valor representa la desviación (SD) de 3 réplicas por tratamiento en 3 experimentos repetidos. Nota: “-” representa que no se ha observado ninguna actividad, mientras que “MR” representa la resistencia a la meticilina.
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3.4. AgNPs contra células cancerosas
Además, la actividad de las AgNPs contra la línea celular cancerosa HT-29 se llevó a cabo mediante el ensayo MTT. Los resultados del estudio se representan en la Figura 7. El porcentaje de viabilidad celular disminuyó con el aumento de las concentraciones de AgNPs de 0 a 500 μg/mL. Evidentemente, esto sugiere que las AgNPs presentan una actividad inhibidora de las células dependiente de la dosis. Además, el aumento del tiempo de exposición de 24 a 48 horas disminuyó el porcentaje de viabilidad celular. Después de 24 horas, los tratamientos de control registraron un 100% de viabilidad celular, mientras que sólo el 7% de las células sobrevivieron a 500 μg/mL de AgNPs, que disminuyó aún más al 2% después de 72 horas de tiempo de incubación. Esto significa un alto efecto de toxicidad de las AgNPs. Aunque las AgNP biosintetizadas muestran una menor toxicidad a dosis bajas, inducen un efecto letal muy elevado a dosis más altas. Del mismo modo, investigadores anteriores han documentado la potencial acción inhibidora de las células de las AgNPs de origen vegetal de forma dependiente de la dosis. Se calculó que el valor IC50 de las AgNPs era de 254, 216 y 174 μg/mL después de 24 horas, 48 horas y 72 horas, respectivamente, de tratamiento.
En un informe anterior, se afirma que el extracto de callo de Safed musli posee varias clases de fitoquímicos . Así, los grupos funcionales reactivos de los fitocompuestos, como los grupos hidroxilo, carboxilo y amino, se acoplan con los iones de plata para mostrar una mayor citotoxicidad. Asimismo, está demostrado que los iones de plata junto con los grupos funcionales reactivos interactúan vigorosamente con la arquitectura celular para causar daño celular.
Además, los iones de plata poseen una fuerte afinidad hacia los grupos sulfhidrilos de las enzimas esenciales y las bases que contienen fósforo. Por lo tanto, las AgNP interactúan eficazmente con los ácidos nucleicos y causan daños en el ADN a través de la interrupción de la cadena respiratoria mitocondrial, fomentando la formación de especies reactivas de oxígeno, inhibiendo la replicación del ADN y la división celular, promoviendo la apoptosis, etc. . Además, otras características de las AgNP, como la naturaleza nanoregética, la forma esférica y la superficie de las partículas, también contribuyen a las propiedades anticancerígenas. Del mismo modo, se ha informado de que los nanomateriales preparados mediante el uso de diversos materiales a granel han dilucidado sus actividades de inhibición celular contra las células de cáncer de colon. En concreto, la actividad anticancerígena se atribuyó principalmente a la composición química de los extractos vegetales y a las características de las nanopartículas, incluyendo el tamaño y las características morfológicas de las AgNPs.
4. Conclusión
En conclusión, este estudio describe un enfoque eficiente, rentable y respetuoso con el medio ambiente para la biosíntesis de AgNPs utilizando el extracto de callo de Safed musli. Las AgNPs biofabricadas poseen forma esférica con un tamaño de partícula que oscila entre 35,1 y 168,0 nm. El patrón de DRX estableció que las AgNPs se presentan en forma de nanocristales, mientras que la observación por AFM confirmó las formas esféricas de las AgNPs. El espectro FTIR reveló la presencia de fitoquímicos en los extractos de callo y se atribuyen a la biosíntesis y estabilización de las AgNPs. Además, la exhibición de actividad antimicrobiana y anticancerígena por parte de las AgNP biosintetizadas sugiere que podrían utilizarse en la fabricación de nanofármacos para aplicaciones terapéuticas, como agentes antimicrobianos, y para el tratamiento del cáncer de colon. En total, estos hallazgos avalan claramente el múltiple potencial de estas AgNPs fitofabricadas.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen dentro del artículo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.