El Dr. Bang estaba muy interesado en los sistemas circulatorios de los invertebrados. Creía que el estudio de los animales en los que se podía observar la circulación conduciría a una mayor comprensión de los procesos fisiológicos de los vertebrados, como los seres humanos.
A principios de la década de 1950, mientras estaba en el Laboratorio de Biología Marina de Wood’s Hole (Maine), Bang estudió el sistema circulatorio del cangrejo herradura y su respuesta a la infección bacteriana.
Inyectaba bacterias obtenidas del agua de mar dulce en cangrejos herradura de distintos tamaños y estudiaba su reacción. Por lo general, la sangre formaba un pequeño coágulo que sellaba la zona infectada e impedía la entrada de más bacterias.
Pero un día, Bang se dio cuenta de que uno de sus cangrejos había muerto a causa de una infección desconocida que había provocado que casi todo el volumen de sangre del cangrejo se coagulara en una masa semisólida.
¡Esto nunca se había visto antes!
Así que aisló y cultivó la bacteria del primer animal y la inyectó en otros cangrejos de herradura. También experimentaron una coagulación idéntica y murieron.
Investigando más, descubrió que sólo las bacterias “Gram-negativas” producían esta reacción.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Las bacterias Gram-negativas causan infecciones como la neumonía y la meningitis. Cuando Bang mató con calor las bacterias antes de la inyección, siguió obteniendo la misma reacción de coagulación. Esto significaba que no se necesitaban bacterias vivas para provocar la coagulación de la sangre del cangrejo herradura.
Publicó sus hallazgos en 1956 y dejó de lado sus observaciones iniciales durante casi 10 años.
Entra Jack Levin.
En 1963, mientras Bang discutía los datos de su proyecto sobre el cangrejo herradura, un colega sugirió que la colaboración con un hematólogo podría ayudar a desvelar el misterio de la coagulación. El colega le recomendó a un investigador de su laboratorio, el doctor Jack Levin.
Levin estaba utilizando conejos para estudiar la reacción de Shwartzman -la reacción a las endotoxinas que provoca la formación de un coágulo en el interior de un vaso sanguíneo y que también altera la función de las plaquetas de los vertebrados.
La endotoxina es un componente clave de la pared celular de todas las bacterias Gram negativas; puede ser difícil de detectar y es resistente a los medicamentos.
Bang convenció a Levin para que pasara un verano en el Laboratorio Biológico Marino de Woods Hole, donde estudió las similitudes entre los amebocitos de Limulus y las plaquetas humanas.
Rápidamente demostró que el plasma libre de células de un cangrejo herradura no se coagulaba, pero cuando estudió las células sanguíneas tuvo problemas para evitar que la sangre se coagulara.
También tenía otro problema. Muestras que estaban bien cuando dejaba el laboratorio por la noche se coagulaban cuando volvía por la mañana, y ninguno de los anticoagulantes del mercado marcaba la diferencia.
La serendipia lleva a un ¡Ajá!
Levin estaba desconcertado y empezaba a estar desesperado por resolver esto.
¿Podría deberse a las bacterias o a algún componente de las mismas?
Para comprobar esta posibilidad, preparó nuevas muestras en material de vidrio estéril y sin endotoxinas. Sorprendentemente, ¡la sangre no coaguló!
Entonces se dio cuenta de que había identificado un mecanismo de coagulación de la sangre que se desencadenaba por la presencia de endotoxinas bacterianas gramnegativas.
Finalmente, pudo demostrar que todo el mecanismo de coagulación de la sangre en Limulus estaba contenido en los amebocitos y era extremadamente sensible a la presencia de endotoxinas.
Amebocitos de Limulus polyphemus
“Creo que sólo un investigador que estuviera trabajando con endotoxinas habría considerado alguna vez la posibilidad de que las endotoxinas estuvieran provocando la coagulación de la sangre de Limulus”, dice Levin.
Esto llevó a Levin a crear y patentar la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), que es extremadamente sensible y permite detectar endotoxinas bacterianas con sangre de cangrejo de herradura.
La única otra prueba para detectar endotoxinas en ese momento se llamaba prueba de pirógenos de conejo. En aquella época, la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. exigía que todos los medicamentos inyectables tuvieran que pasar la prueba de pirógenos antes de que se aprobara su uso.
Sin embargo, la prueba de pirógenos en conejos era un proceso costoso, ineficiente y a menudo inexacto.
Se inyectaba la muestra en un grupo de conejos. Si a los conejos les daba fiebre, el fármaco no pasaba la prueba. Si no tenían fiebre en un plazo de 4 a 6 horas, pasaba.
Las empresas farmacéuticas tenían que albergar miles de conejos para poder realizar estas pruebas.
La prueba LAL puede devolver un resultado en tan sólo 45 minutos y puede detectar la presencia de endotoxinas a niveles de menos de una parte por billón.
Levin se dio cuenta de que tenía un ensayo muy sensible y rápido. Esto supuso una dura competencia para la prueba del conejo.
La prueba LAL puede devolver un resultado en tan sólo 45 minutos y puede detectar la presencia de endotoxinas a niveles de menos de una parte por trillón.
Aunque la prueba LAL se describió por primera vez en 1965, pasaron casi 20 años antes de que la prueba fuera aprobada formalmente como prueba de endotoxinas en productos finales por la FDA
¿Por qué se tardó tanto? ¡Adoptar la nueva prueba, más sensible, significaba que las compañías farmacéuticas tendrían que reequipar y establecer toda una nueva línea de producción.
¡Eso es tiempo y dinero!
Pero la crema eventualmente sube a la cima; ¡esta prueba era la crema de la cosecha y todavía lo es!
La demanda de LAL es ahora tan alta que se ha convertido en uno de los líquidos más valiosos de la Tierra, con un precio reportado en abril de 2018 de entre $ 35,000 y $ 60,000 por galón!
Ampliación de la prueba de LAL
La prueba de LAL ha sido nombrada una de las “100 contribuciones más importantes a la salud pública” por la Escuela de Salud Pública Bloomberg de Johns Hopkins.
Según Jack Levin, es la prueba de detección estándar para la contaminación por endotoxinas en todo el mundo, con aproximadamente 17,5 millones de muestras analizadas (lo que equivale a unos 70 millones de pruebas realizadas) cada año. Se utiliza comercialmente para analizar todos los fluidos intravenosos, los fármacos parenterales y los dispositivos médicos implantables antes de que se utilicen en los pacientes.
¿Cómo se hace la LAL?
Los cangrejos herradura se capturan y se les clava un tubo para sifonar su sangre (ver la foto de arriba). A continuación, la sangre recogida se centrifuga para concentrar los amebocitos. La adición de agua a los amebocitos empaquetados hace que se rompan y liberen las proteínas de coagulación (el lisado) que reaccionan con las endotoxinas.
Esta forma de hacer LAL se promociona como un método no letal de obtener sangre del cangrejo. Pero no lo es. Porque no todos los cangrejos sobreviven!
Según la Comisión de Pesca Marina del Estado del Atlántico, en su informe de evaluación de referencia de la población del cangrejo herradura y de revisión por pares de 2019, se capturan y desangran 600.000 cangrejos herradura para satisfacer la demanda anual de LAL.
De esos 600.000 cangrejos, aproximadamente 420-540.000 (70-90 %) sobreviven al procedimiento. Si unimos esto a la invasión del hábitat, al calentamiento global y a los más de 500.000 que se capturan y matan cada año para utilizarlos como cebo en las pesquerías de anguila y ballena, podemos ver por qué las poblaciones de cangrejo herradura están cayendo en picado.
No sólo eso, sino que los cangrejos son cosechados en mayo y junio, cuando llegan a la costa en masa para aparearse, poner sus huevos y, con suerte, mantener su supervivencia.
¡Esta no es una situación sostenible!
¿Hay mejores maneras de hacer LAL?
“El cangrejo herradura americano sobrevivió a los dinosaurios y a cuatro extinciones masivas anteriores, pero ahora está amenazado por la industria farmacéutica, las comunidades pesqueras, la pérdida de hábitat, el cambio climático y, más recientemente, las mareas asfixiantes de algas rojas en la costa este de Estados Unidos.”de Jonathan Watts en The Guardian
Hay dos esfuerzos principales que se están promoviendo como formas de mitigar esta desafortunada situación.
Un enfoque que está probando la industria farmacéutica es la acuicultura de cangrejos herradura.
Al principio, los intentos de cultivar cangrejos herradura no tuvieron mucho éxito. Al parecer, tras 3-4 meses de cultivo, las concentraciones de proteínas de la hemolinfa descendían a niveles que provocaban la mortalidad. Se pensó que estas muertes estaban relacionadas con deficiencias nutricionales.
El Dr. Anthony Dellinger es profesor del departamento de neurociencia de la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro y científico de Kepley Biosystems Incorporated, en Greensboro, Carolina del Norte.
Dellinger y KBI han trabajado duro para desarrollar un nuevo sistema de acuicultura mejorado. Su premisa es que “la recogida controlada de LAL a partir de cangrejos de herradura monitorizados y bien mantenidos en la acuicultura podría aumentar las cantidades de suministro de LAL, garantizar la viabilidad de las especies y permitir nuevas innovaciones clínicas”.
Si tiene éxito, producir mayores volúmenes de LAL de forma fiable, sostenible y económica beneficiaría tanto a la naturaleza como a la industria.
Dellinger y sus colegas describieron en detalle el funcionamiento de su sistema de acuicultura en un artículo publicado en Frontiers of Marine Science el pasado mes de abril.
Veamos los aspectos más destacados y los resultados de ese estudio.
En primer lugar, optimizaron un sistema de acuicultura de recirculación en interiores que mantiene los cangrejos de herradura de forma fiable. Su objetivo era facilitar la recolección repetitiva de LAL manteniendo el bienestar de los animales.
El siguiente hito fue conseguir un método de recolección repetitiva de bajo impacto. Para ello, implantaron quirúrgicamente un catéter en el cangrejo herradura. Todas sus pruebas demostraron que los cangrejos herradura toleraban bastante bien estos catéteres.
Aquí hay un resumen rápido de sus resultados.
Colectaron y mantuvieron 24 cangrejos durante un año con un 100% de supervivencia. Los cangrejos de herradura fueron comprobados para la actividad LAL, la liberación de huevos y esperma y otros signos que podrían indicar una salud deteriorada. No se observó ningún signo de este tipo.
Los cangrejos fueron sangrados por los catéteres unas tres veces al mes, lo que equivale potencialmente a unas 36 hemorragias por cangrejo durante el periodo de 12 meses. No se encontró ningún problema con los catéteres implantados durante este período.
Cuando calcularon los costes incurridos, fuera de la disposición inicial del sistema de acuicultura, el mantenimiento de los cangrejos ascendió a unos 0,76 dólares por libra, ¡una cantidad muy asequible!
La pregunta más importante que había que responder era:
¿Cómo se compara la LAL de los cangrejos de herradura mantenidos en casa con la obtenida de los cangrejos recién recolectados?
Como se muestra en la figura 6 de su artículo, no hubo diferencias significativas en la actividad de coagulación de endotoxinas de la LAL entre los cangrejos de acuicultura y los salvajes. Y tampoco hubo diferencias reales en la actividad de los sangrados tomados en los días 1, 16 y 23.
Estos resultados les llevaron a concluir,
“…la acuicultura podría satisfacer las necesidades de la industria durante varios años con el equivalente al 5-10% de las capturas anuales de un año, dejando cerca de 600.000 HSC en la naturaleza cada año a partir de entonces. De hecho, estos hallazgos sugieren que ∼60.000 HSC de acuicultura podrían sangrarse de forma sostenible entre 12 y 24 veces al año y superar la demanda actual de LAL biomédica.”
El segundo enfoque elimina la necesidad de cangrejos por completo.
Jeak Ling Ding, junto con su marido y compañero de investigación Bow Ho, en Singapur, tenían un objetivo: eliminar por completo la necesidad de cangrejos de herradura.
Estaba estudiando el Carcinoscorpius rotundicauda, una especie asiática que era mucho más pequeña que los cangrejos herradura del Atlántico, y que no podía desangrarse mucho sin morir.
Las investigaciones de Ding sobre el LAL llevaron a descubrir que una molécula llamada factor C era la responsable de su acción coagulante. Ding aisló el gen del factor C y utilizó un virus para insertarlo en las células intestinales de los insectos. Esto convirtió a los insectos en pequeñas fábricas que producían el factor C.
Los insectos modificados producían cantidades suficientes de factor C, que podían venderse como factor C recombinante* (rFC) en el mercado como un sustituto viable de la LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Así que ahora, en lugar de recolectar o acuicultar cangrejos de herradura y sangrarlos, podrían cultivar grandes cantidades de insectos y aislar el rFC.
Las empresas farmacéuticas que han utilizado el rFC han confirmado que funciona igual de bien que la LAL y que los costes de producción son comparables.
“Estábamos tan entusiasmados como investigadores, tan contentos de que funcionara”, dijo Ding. “Y pensamos que el factor C recombinante se adoptaría en todo el mundo y que el cangrejo herradura se salvaría”.
Desgraciadamente, el rFC se enfrentó a los mismos obstáculos para su aceptación que la LAL cuando se introdujo. Aunque el rFC lleva en el mercado desde 2003, ha tardado en ganar adeptos. Pero poco a poco está superando los obstáculos para su aprobación por la FDA. Al principio solo lo producía un fabricante: la empresa química con sede en Suiza, el Grupo Lonza.
En 2013, Hyglos GmbH se convirtió en la segunda empresa en fabricar rFC. Kevin Williams, científico principal de Hyglos, afirma que considera que la adopción y la aprobación del rFC son necesarias desde hace tiempo. Hyglos GmbH ha obtenido la aprobación para su uso por parte de varias agencias reguladoras europeas.
Hoy en día, los expertos creen que, en última instancia, la rFC se convertirá en el método dominante de detección de endotoxinas, dejando a los cangrejos de herradura completamente fuera del gancho de la producción industrial.
¡Eso es algo con lo que los cangrejos herradura pueden vivir!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Lo que nos lleva a la última cuestión que quiero analizar:
¿Por qué nos importa que los cangrejos herradura sobrevivan, de todos modos?
¿No son sólo reliquias antiguas de las que nuestro ecosistema moderno podría prescindir fácilmente? Muchas otras especies se han extinguido y el planeta parece estar bastante bien.
Es una pregunta válida, así que vamos a profundizar un poco más.
La respuesta instintiva es, “¡por supuesto que queremos salvarlos!”. Ya tenemos suficientes criaturas en este planeta amenazadas o que ya se han extinguido. Simplemente no podemos permitirnos perder más.
Como dije, eso es más una reacción visceral, no una respuesta en la que se pueda colgar el sombrero. Para una mejor respuesta, tenemos que ver cómo los cangrejos de herradura encajan en el panorama general.
Empecemos con lo que comen y lo que los come.
El cangrejo de herradura adulto se alimenta de pequeños moluscos como el mejillón azul y la almeja de mar, y de gusanos anélidos.
A partir de 2017, los mejillones azules no están en grave peligro según este informe del Centro Safina de la Universidad de Stony Brook. Lo mismo ocurre con los anélidos y las almejas de mar.
Los juveniles se alimentan de pequeñas partículas tanto de algas como de materia animal. A medida que el animal crece en tamaño, también lo hace la presa que consume.
En general, parece que los cangrejos de herradura no tienen ningún efecto perjudicial sobre sus especies de presa.
Ok, esa es una cara de la moneda. ¿Qué hay de la otra? ¿Qué come cangrejos de herradura?
Los huevos del cangrejo herradura son una fuente de alimento para muchos organismos.
Estos incluyen aves costeras, algunos peces -lubina rayada, killifish rayado, pejerrey, platija- así como tortugas marinas, cangrejos y buccinos. Son una fuente de alimento fundamental para 11 especies de aves costeras migratorias. La pérdida de estos huevos devastaría esas poblaciones de aves.
Las tortugas bobas y las aves costeras, como el correlimos rojo, dependen de los cangrejos de herradura.
Miles de estas tortugas migran a la Bahía de Chesapeake y Delaware en verano para alimentarse de los cangrejos. Ahora se cree que las caguamas están sufriendo la falta de cangrejos de herradura en Chesapeake.
Algunas anécdotas informan de la aparición de cangrejos de herradura en los vientres de caimanes y tiburones.
Las crías de cangrejo de herradura también podrían ser un alimento clave en la red alimentaria costera. Durante el verano y el otoño, las larvas y las primeras etapas de vida de los cangrejos herradura pululan por las aguas poco profundas. No cabe duda de que los peces y las aves costeras también engullen estos bocados.
Y parece que hay muchos otros animales que los encuentran bastante apetecibles y que les sería difícil encontrar sustitutos fáciles.
Para una criatura que existe desde hace 450 millones de años, nuestra comprensión dista mucho de ser completa sobre el papel que desempeña Limulus polyphemus en el ecosistema costero.
Con el estado actual de nuestros conocimientos sobre la ecología del cangrejo de herradura, no podemos llegar a ninguna conclusión definitiva sobre lo esencial de su papel. Lo que podemos decir es que definitivamente ocupan un nicho que justifica un estudio más serio.
Aún así, ¡me pongo del lado de la necesidad de conservarlos! Es mi actitud de “más vale prevenir que curar”. Simplemente sabemos demasiado poco como para dejar que una especie como Limulus polyphemus se nos escape de las manos y desaparezca si podemos evitarlo.
Entonces, ¿hay algo que puedas hacer?
Si por casualidad vives cerca de un lugar donde los cangrejos de herradura vienen a poner huevos, es fácil lanzarte y ayudar. Hay programas de volteo de cangrejos y estudios de desove de cangrejos que dependen de voluntarios.
Y por último, acuérdate del cangrejo herradura cuando vayas al médico. ¡Todo lo que se inyecta o implanta en nuestro cuerpo se sigue analizando para detectar la contaminación bacteriana gramnegativa con LAL hecha con sangre de cangrejo de herradura.
Hasta la próxima
Rich
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Fuentes de información utilizadas para este artículo:
- El cangrejo herradura
- La acuicultura del cangrejo herradura como fuente sostenible de pruebas de endotoxinas
- El papel del cangrejo herradura en la industria biomédica y las tendencias recientes que afectan a la sostenibilidad de la especie
- Los últimos días de laSangre azul
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