Linda Boettger1,2 and Diane P. Genereux2

1. Stanford University School of Medicine; 2. Broad Institute of MIT and Harvard

U čistokrevných psů a příležitostně i u kříženců první generace služby pro určení plemene často jen potvrzují to, co majitel psa již ví. Někdy je k dispozici rodokmen, který sleduje několik generací čistokrevných předků a poskytuje v podstatě kompletní informace o původu zvířete. V jiných případech vede rozsáhlá zkušenost majitele ke správné intuici, že uši, které plandají, spolu s nosem, který se drží, musí ukazovat na úplný nebo téměř úplný původ bígla. Naproti tomu při použití pro zkoumání původu voříška vede odvozování na základě DNA často k překvapivým závěrům.

Odvozování původu na základě DNA může mít velkou praktickou hodnotu. Může sloužit k urovnání rodinných debat o původu milovaného voříška a může nabídnout alespoň vyhlídku na ochranu zdraví domácího mazlíčka. Například zjištění, že voříšek má předky z plemene, o kterém je známo, že má vysoké riziko rakoviny, by mohlo doporučit častější screening nádorů.

Stejně jako každá nová metoda však ani odvozování původu není bez problémů a nejistot. Zde uvádíme podklady potenciálně užitečné pro ty, kteří zvažují službu určení původu nebo se snaží interpretovat překvapivé výsledky. Začneme pojednáním o biologických procesech, které dávají vzniknout fascinujícím, komplexním genomům mutantů, a poté poskytneme přehled o tom, jak se stávající přístupy snaží tuto genomickou komplexnost rozklíčovat, aby poskytly vhled do původu plemene. V závěru se zabýváme některými problémy, které mohou ohrozit závěry o původu, a komentujeme, jaké druhy informací budou v příštích několika letech zapotřebí k vyřešení těchto problémů.

Co je to čistokrevný pes? Co je to voříšek?

Chceme-li dospět k přesné definici voříška, je užitečné se zamyslet nad tím, jak psi nejprve vznikli. Dostupné údaje naznačují, že původně náhodné interakce s lidmi by mohly vysvětlit jejich dávný původ (Larson a Fuller, 2014). Předpokládejme pro tuto chvíli, že někteří dávní vlci byli vůči lidem ostražití a jiní byli relativně pohodlní. Podle této interpretace mohla rostoucí dostupnost zbytků lidské potravy s rozšiřováním lidských populací poskytnout nový hlavní zdroj potravy pro společenštější vlky. Nakonec tato zvířata vytvořila samostatnou populaci zvířat, která dávala přednost životu v těsné blízkosti člověka a měla tendenci se pářit spíše mezi sebou než se svými divočejšími příbuznými.

Pokud, jak vyžaduje jakýkoli evoluční scénář, existoval genetický základ pro znak odlišující tyto dvě počínající populace – zde by to byl soubor mutací, které modulují pohodlí jednotlivých vlků v blízkosti lidí – pak je možné, že dostupnost potravy v blízkosti lidských populací vysvětluje původ psů z jejich divokých vlčích předků. Je důležité poznamenat, že podle tohoto scénáře nebyli psi domestikováni lidmi jako takovými. Místo toho lidé jednoduše vytvořili prostředí, které umožnilo samodomestikaci podskupiny vlků, kteří byli shodou okolností geneticky předurčeni k tomu, aby byli alespoň trochu tolerantní vůči lidem.

Obrázek 1. Původ moderních plemen. Ačkoli přesné načasování zůstává sporné, obecně se předpokládá, že psi vznikli jako populace odlišná od předků vlků v Eurasii před 10 000 až 40 000 lety (Larson a Fuller, 2014). Podle tohoto scénáře byla sice většina vlků nadále ostražitá vůči lidem a podléhala přírodnímu výběru ve volné přírodě, ale několik jedinců bylo schopno tolerovat život v blízkosti člověka a možná i využívat jeho potravní odpad. Tato podskupina vlků nakonec dala vzniknout geneticky odlišné populaci zvířat schopných žít v blízkosti člověka. Specifická plemena psů vznikla mnohem později, většina plemen se zformovala před méně než 150 lety (Larson et al., 2012). Během tohoto procesu byli psi vyšlechtěni do různých linií na základě selekce pro specifické vlastnosti, jako je boj, pasení, lov nebo jen být dobrým společníkem.

Obecně se předpokládá, že moderní plemena psů vznikla přibližně před 150 lety, během viktoriánské éry – dlouho po vzniku psů z jejich vlčích předků. Tento závěr vychází z pozorování, že lidé vytvářejí párové páry psů, kteří mají společné znaky považované za užitečné pro specifické úkoly, čímž vznikají odlišné skupiny psů stále více obohacené o genetické mutace kódující specifické vlastnosti (Larson et al., 2012). Jako v každém evolučním procesu vznikaly příslušné mutace zpočátku náhodně a později byly zvýhodněny selektivním šlechtěním. Různé skupiny, včetně American Kennel Club a Kennel Club of India, nakonec definovaly odlišná plemena, což nakonec vedlo k definici čistokrevného psa jako psa, jehož veškerý původ je zastoupen jedinci zapsanými v plemenné knize (“Inherited Defects in Pedigree Dogs. Část 2: Poruchy, které nesouvisejí se standardy plemen,” 2010). V kontextu selektivních šlechtitelských procesů, které nejprve vytvořily a nyní udržují odlišná plemena, lze voříška definovat jako psa, jehož předci pocházejí z více než jedné geneticky odlišné linie.

Cílem odvozování původu je tedy pomocí genetických informací z mutta odvodit, která plemena psů byla přítomna mezi jeho předky, a odvodit jejich relativní genetický přínos.

Odběr DNA ze psa

Prvním krokem při odvozování původu je odběr a extrakce DNA pro genetické posouzení. Naštěstí jsou skvělým zdrojem DNA sliny – a většina majitelů zjistí, že jejich odběr je poměrně snadný. Stačí pár okamžiků v tlamě psa a jeden z odběrových tamponů poskytovaných komerční genotypizační službou se obvykle pokryje množstvím buněk. Tyto buňky jsou většinou dvojího druhu: bílé krvinky, které jsou suspendovány ve slinách a pomáhají při imunitních reakcích, a epitelové buňky, které vystýlají tlamu a obvykle se vyměňují přibližně každých 24 hodin. Jakmile jsou buňky odebrány, je stěr (obr. 2A) zaslán společnosti zabývající se určováním původu. Tam jsou porušeny buněčné membrány (obr. 2B), čímž se uvolní buněčné jádro (obr. 2C), které obsahuje DNA, a poté se z jádra uvolní DNA (obr. 2D). Proteiny a další biomolekuly pak mohou být odplaveny, čímž se získá vysoce kvalitní vzorek DNA.

Obrázek 2. Izolace DNA pro odvození původu. Během několika okamžiků v psí tlamě zachytí stěr slin (A) mnoho epiteliálních a imunitních buněk (B). Poté lze z buněk izolovat jádra (C) a následnou lýzou uvolnit DNA (D), kterou lze následně vyčistit a použít pro genotypizaci nebo sekvenování.

Přestože je tento postup izolace DNA ze slinných stěrů působivě robustní a lze z něj získat vysoce kvalitní DNA jak od velkých psů, tak od malých psů, dospělých jedinců i štěňat, není bez záhad. Letos v létě jsme například s několika kolegy odebírali týdenní vzorky slin od šesti štěňat. K našemu překvapení se poměr bílých krvinek a epitelových buněk v jednom vzorku slin u jednotlivých jedinců i v jednotlivých týdnech velmi lišil. Ještě překvapivější bylo, že jedno mládě mělo trvale mnohem více buněk na vzorek než jeho sestry a bratři. Doufáme, že se nakonec dozvíme, co by mohlo vysvětlit tuto dramatickou variabilitu. V tuto chvíli je však uklidňující, že i vzorky s nejnižší výtěžností obvykle obsahují dostatek DNA pro odvození původu.

Jak vyrobit voříška: Dědičnost a výměna chromozomů

U lidí i psů přispívají matka a otec ke genomům svých potomků téměř stejnou měrou. Genom psa je rozdělen na 38 párů autozomů (lidé mají 22 sad) a jeden pár pohlavních chromozomů (i lidé mají jeden pár pohlavních chromozomů). Každý z 38 párů psích autozomů se skládá z jednoho chromozomu dodaného vajíčkem od matky a jednoho dodaného spermií od otce. Genom mitochondrie, malého úseku DNA, který obsahuje mnoho genů podílejících se na látkové výměně, vždy dodává máma.

Pro modelování genetického původu voříška uvažujme nejprve spojení dvou čistokrevných psů: psa labradorského retrívra a feny pudla. Spermie samce a vajíčko samice, z nichž každý nese jednu kopii každého chromozomu, se spojí a vznikne směs labradora a pudla, která nese jednu kopii každého chromozomu, na níž se podílel každý z rodičů.

Obr.3. Vajíčko samice pudla je oplodněno spermií samce labradorského retrívra, čímž vznikne směs labradora a pudla. Pro každý pár chromozomů má potomek jednu kopii od matky (fialová) a jednu od otce (růžová). Poznámka: Pro přehlednost je na tomto a následujících obrázcích zobrazen pouze jeden z 39 párů psích chromozomů.

Při paralelním páření se páří samice bígla a samec mopse, čímž vznikne samec směsi mopse a bígla.

Obrázek 4. Vajíčko fenky bígla je oplodněno spermií samce mopse. Vajíčko samice bígla je oplodněno spermií samce mopse, čímž vznikne směs mopse a bígla. Pro každý pár chromozomů má potomek jednu kopii od matky (černá) a jednu kopii od otce (modrá).

Abychom pochopili, jak vzniká voříšek, který obsahuje genetické vklady několika různých plemen, musíme pokračovat do další generace. Stejně jako předtím přispívají oba, maminka – zde labrador – a tatínek – zde mopslík – jedním z chromozomů v každém páru. Avšak namísto předávání stejných chromozomů, které sami zdědili, přispívají rodiče rekombinovanými chromozomy, které jsou kombinací fragmentů od jejich vlastních rodičů (obrázek 5). V tomto příkladu by se výsledné štěně nazývalo mutt a mělo by DNA pocházející od předků čtyř různých plemen.

Obrázek 5. Vajíčko samice labradorského pudla je oplodněno spermií samce směsi mopse a bígla, čímž vznikne voříšek. Pro každý pár chromozomů zdědí potomek jednu kopii chromozomu od matky (fialový a růžový) a jednu kopii chromozomu od otce (černý a modrý). Při tomto páření jsou oba rodiče sami míšenci. Proto když směs labradora a pudla produkuje vajíčka a směs mopse a bígla produkuje spermie, výsledné chromozomy obsahují DNA více než jednoho plemene.

Rekombinace zahrnuje spravedlivou výměnu genetického materiálu mezi dvěma chromozomy, které tvoří každý pár. Při každé rekombinaci vzniká nová verze původního chromozomu, u níž je celkové množství genetického materiálu stejné jako předtím, ale je jinak rozděleno mezi oba chromozomy. Všimněte si, že rekombinace je vlastní produkci spermií a vajíček – dokonce i u čistokrevného bígla nebo pudla si chromozomy v rámci každého páru vyměňují kousky. Důsledky jsou však nejvíce patrné, když mají rekombinující chromozomy odlišnou historii.

Odvození původu voříška porovnáním s referenčními genomy čistokrevných psů

Odvození místního původu funguje tak, že se určí, které plemeno s největší pravděpodobností přispělo jednotlivými částmi genomu voříška. Jakmile je proveden závěr pro každý úsek chromozomu, lze tyto závěry sečíst a odhadnout celkový podíl genomu mutta, na kterém se podílelo každé předpokládané plemeno.

Pro odvození nejpravděpodobnějšího přispěvatele daného úseku chromozomu samozřejmě potřebujeme nějaký způsob, jak rozlišit mezi genetickými příspěvky různých plemen. Naštěstí, zatímco většina genomu je u všech psů velmi podobná, každé plemeno obsahuje specifické genetické změny – tzv. mutace – které jsou pro něj buď jedinečné, nebo alespoň mnohem častější než u jiných plemen. Některé z těchto mutací mají přímý význam pro vlastnosti konkrétního plemene. Jiné jsou pouze jedinečné nebo častější u jednoho plemene než u jiných, ale nemají žádný známý význam pro specifické fyzické vlastnosti plemene. Oba typy mutací jsou užitečné pro odvození původu. Na obrázcích 3-6 jsou mutace specifické pro jednotlivá plemena, užitečné pro odvození původu plemene, znázorněny barvou chromozomů.

Obrázek 6. Odvození původu plemene porovnáním genomu mutta se souborem referenčních genomů. Pro odvození původu plemene pro mutta se shromáždí soubor referenčních genomů plemene (A) a poté se porovná s genomem mutta, který je předmětem zájmu (B), aby bylo možné odvodit původ pro každou část chromozomu a odhadnout celkový příspěvek k původu. U výše uvedeného mutta se předpokládá zhruba stejný podíl předků mopse, labradorského retrívra, pudla a bígla, jak se očekávalo vzhledem k tomu, že měl jednoho prarodiče z každého z těchto čtyř různých plemen.

Kroky při odvozování původu pro voříška pak jsou následující:

1. Shromáždit soubor genetických údajů od čistokrevných psů (obrázek 6A)
2. Shromáždit genetické údaje od mutta, který je předmětem zájmu (obrázek 6B)
3. Porovnat genom mutta s referenčním genomem, provést nejlepší odhad původu plemene pro každý kus chromozomu, a sečtením těchto částí chromozomů odhadněte celkový původ plemene (obrázek 6C)

Data i jen z malého zlomku genomu mutta mohou být užitečná pro odvození původu

Genom psa obsahuje přibližně 2.5 miliard nukleotidů – As, Ts, Cs a G, které tvoří DNA. To se nijak drasticky neliší od zhruba 3 miliard nukleotidů, které tvoří lidský genom. V ideálním světě by samozřejmě bylo finančně únosné shromáždit údaje o sekvenci celého genomu každého psa. V posledních dvou desetiletích jsme se k tomuto cíli přiblížili. V roce 2001, kdy byla zveřejněna první kompletní sekvence lidského genomu, stálo sekvenování každého z našich přibližně 3 miliard nukleotidů 2,7 miliardy dolarů. Masivní pokles nákladů na sekvenování umožnil rozsáhlé projekty, jako je projekt 1 000 genomů, který katalogizuje sekvence celých genomů lidí z celého světa.

I přes tento pokles cen stojí sekvenování celého genomu psa na Genomické platformě Broad Institute stále přibližně 1400 dolarů. Tato cena je jistě výrazným zlepšením oproti dřívějším cenám, ale zůstává značná. Naštěstí genotypování poskytuje levnější – a stále do značné míry informativní – alternativu. Na rozdíl od sekvenování celého genomu se při genotypování zkoumá podmnožina nukleotidů v genomu. Například v případě genomu psa nejpopulárnější čip testuje přibližně 170 000 mutací.

Na první pohled je těžké si představit, jak by údaje z pouhých asi 0,000068 % genomu voříška (170 000 z 2,5 miliardy) mohly poskytnout adekvátní náhradu za celkový genom. Část odpovědi spočívá v detailech výše zmíněného procesu rekombinace. V každé generaci se kousky chromozomů odvozené od daného předka stále zmenšují. Navzdory tomuto celkovému poklesu délky zůstávají kousky chromozomů po mnoho generací v poměru k celému genomu velké. Proto je s určitými důležitými výhradami – a s vědomím, že se nevyhnutelně vyskytnou určité chyby – obvykle rozumné použít identitu jednoho nukleotidu v genomu mutta k odhadu identity sousedního nukleotidu (obrázek 7). Tento přístup, označovaný jako imputace, výrazně zlepšil možnosti relativně levného odvozování složek původu u psů smíšených plemen.

Obrázek 7. Imputace využívá informace o genotypu z některých nukleotidů k informovanému odhadu jiných. U chromozomu vzniklého rekombinací DNA z DNA pudla (fialová) a labradorského retrívra (růžová) umožňuje identifikace plemenného původu pozic 1 a 2, na nichž se podílel labradorský retrívr, správný odhad plemenného původu okolní oblasti. Naproti tomu pozice 3 se nachází v blízkosti bodu zlomu mezi kusy chromozomu; údaje z tohoto místa vedou ke správnému odhadu původu pozic nalevo, ale nikoli napravo od vzorkované pozice.

Jak funguje genotypovací čip?

Genotypovací čipy pro psy navržené společnostmi jako Affymetrix a Illumina jsou optimalizovány pro identifikaci mutací relevantních pro onemocnění. Výsledkem je, že se u každého psa zkoumá pouze podskupina mutací, u nichž je největší pravděpodobnost, že budou mít klinický význam, což snižuje náklady.

DNA je velmi lepivá dvouřetězcová molekula, v níž se každé vlákno chce vázat na druhou, komplementární sekvenci. V DNA všeho živého na Zemi se A (adenin) páruje s T (thyminem) a C (cytosin) se páruje s G (guaninem). Proto by se sekvence DNA “ATCG” držela komplementární sekvence “TAGC”. Avšak i rozdíl jednoho písmene (tj. “TGGC”) může zabránit tomu, aby se obě části DNA na sebe navázaly. Genotypové čipy využívají tohoto principu selektivní vazby k určení, které mutace jsou u daného psa přítomny. Sondy DNA jsou navrženy tak, aby vázaly úseky DNA psa obsahující mutovanou a alternativně nemutovanou formu DNA. Tyto krátké sekvence jsou připevněny k horní části malého skleněného sklíčka, které se běžně označuje jako “čip” nebo “pole” (Obrázek 8).

Obrázek 8. Genotypizace k určení, které mutace má každý pes. Sondy DNA (krátké sekvence komplementární k zájmovým mutacím) se nacházejí na různých místech genotypizačního pole. Zde je znázorněna detekce jedné z tisíců mutací testovaných pomocí čipu. Po přidání psí DNA a jejím navázání na DNA na čipu se DNA, která se nenavázala, smyje. Poté se přidají fluorescenční molekuly, které se naváží na zbývající psí DNA. Tímto způsobem lze identifikovat mutace přítomné u psa vizualizací toho, které oblasti genotypovacího pole svítí.

Pro zajištění vazby na tyto krátké genotypovací sondy se DNA izolovaná ze slin voříška nejprve rozdělí na malé kousky. Poté se k DNA psa připojí chemická látka, která skvěle přilne k fluorescenčním molekulám, jež budou rozhodující pro interpretaci výsledků. DNA voříška se promyje přes čip a každé vlákno naváže svou komplementární sekvenci sondy. Kousky DNA voříška tak najdou odpovídající sondu na genotypovacím čipu. Dvě vlastnosti zajišťují specifickou vazbu, a tedy spolehlivé údaje. Za prvé, genotypizační sonda nemůže vázat DNA mutta pocházející z jiné části genomu. Za druhé, nemůže vázat mutovanou formu sekvence, pokud pes náhodou nemá tuto specifickou mutaci (tj. výše znázorněnou sekvenci “A”). Nenavázaná DNA se ze sklíčka smyje a nakonec se ke zbývající DNA, která úspěšně navázala sondy, připojí fluorescenční molekuly. Protože každá sonda byla vytvořena na určitém místě na matrici, můžeme interpretovat, které mutace pes má, pozorováním toho, která malá místa na matrici svítí.

Faktory, které mohou zpochybnit odvození původu

I přes nedávné pokroky může několik přetrvávajících problémů zpochybnit snahy o přesné odvození původu plemene u psů smíšených plemen.

Obrázek 9. Předka lze odvodit, pouze pokud je příslušný genom přítomen v referenčním souboru. U plemen, která jsou dobře zastoupena mezi referenčními genomy a dobře vzorkována genotypovacím polem (například pudl, mopslík a labradorský retrívr ve výše uvedeném scénáři), budou snahy o odvození předků obvykle úspěšné při určování jak přítomnosti, tak přibližného procenta DNA přispívajícího nedávnými předky daného plemene. U plemen, která nejsou mezi referenčními genomy dostatečně zastoupena (například bígl ve výše uvedeném scénáři), jsou však části chromozomů často nesprávně přiřazeny lépe zastoupenému plemeni (například baset ve výše uvedeném scénáři), což vede k nesprávnému posouzení původu voříška.

Zatímco některé problémy mohou vést k pouhému podhodnocení procenta původu voříška, které pochází z určitého plemene, jiné problémy mohou zabránit tomu, aby bylo správné plemeno vůbec identifikováno. Nejpodstatnějším z těchto problémů je absence skutečného plemene předků v referenčním souboru dat (obrázek 9). Vzhledem k tomu, že původ plemene se odvozuje porovnáváním částí DNA voříšků s čistokrevnými psy známých plemen, pokud plemeno v referenčním souboru dat chybí, nelze toto plemeno jednoduše zjistit, i kdyby přispělo velmi velkou částí DNA voříška. Tento problém bude nakonec vyřešen pouze zahrnutím referenčních genomů uznaných plemen; do té doby, pokud máte zájem zjistit, zda má váš pes předky z určitého vzácného plemene, je důležité se ujistit, že vámi vybraná společnost zabývající se analýzou předků plemen je schopna toto plemeno zkontrolovat. Pro ty, kteří se rozhodnou pokračovat v odvozování předků, přestože je známo, že plemeno, které je předmětem zájmu, v referenčním souboru chybí, je důležité mít na paměti, že nepřítomnost tohoto plemene v seznamu odvozených předků neposkytuje žádnou informaci o tom, zda voříšek skutečně nemá daného předka.

Mutace vybrané pro genotypizaci také určují, které předky plemen lze u psa smíšeného plemene přesně identifikovat. Genotypizační matrice obvykle zahrnují více mutací přítomných u běžných plemen. To znamená, že kusy chromozomů pudlů a německých ovčáků mohou být obzvláště snadno identifikovatelné, protože mnoho mutací běžných u těchto plemen je testováno na genotypovacích maticích. Zatímco mnoho mutací by mohlo pomoci identifikovat kusy DNA vzácných plemen, jako jsou novoguinejští pěvci nebo skye teriéři, některé z těchto mutací nemusí být zastoupeny na široce používaných genotypovacích maticích, což by mohlo ztížit identifikaci těchto plemen. Tento problém bude nakonec vyřešen vytvořením referenčních souborů dat o plemenech se sekvenčními údaji, které by umožnily interpretaci mnohem většího počtu mutací a nebyly by zkreslené směrem k detekci původu z konkrétních plemen.

Spolehlivost určení plemene ovlivňuje také příbuzenský vztah voříška k jeho čistokrevným předkům. Zejména je snazší určit plemenný původ DNA z čistokrevného předka, který je blízkým příbuzným (například rodičem), protože mutace z nedávných předků se budou nacházet v delších úsecích DNA s více informativními mutacemi. Například zatímco první pozorovaná mutace na chromozomu mutanta může být společná pro labradory i zlaté retrívry, možná se první, druhá a třetí pozorovaná mutace vyskytují společně pouze u zlatých retrívrů. DNA, kterou přispěli předci z mnoha generací zpět, bude existovat pouze jako krátké kousky chromozomů s menším počtem mutací, které by pomohly určit jejich podíl na původu mutta, což ztěžuje vyvozování závěrů. Tento problém lze zmírnit použitím dat ze sekvenování namísto genotypování, což umožní analyzovat všechny mutace. DNA zděděná z mnoha generací zpět však může být v tak krátkých úsecích chromozomů, že nebude obsahovat úseky chromozomů charakteristické pro konkrétní plemeno, takže příspěvek plemene k původu mutta nelze zjistit ani pomocí celogenomových dat (Li et al., 2014).

Co bude dál? Měl bych genotypizovat svého psa?”

Stejně jako každá nová technologie je i odvozování plemen vzrušující příležitostí, která přináší některé nevyřešené problémy. Mnoho majitelů psů, které zajímá, jak se dozvědět více o původu svého domácího mazlíčka, jistě ocení, když budou mít možnost nahlédnout do toho, která plemena se podílela na jedinečné genetice jejich voříška. Možná dokonce získáte právo spekulovat, že vynikající výdrž vašeho psa ve vysokých nadmořských výškách pochází od jeho prarodiče plemene Lhasa Apso (Li et al., 2014)! Přesto vyzýváme majitele, aby byli obezřetní a pamatovali na to, že spolehlivost závěrů mohou ohrozit různé problémy, a zároveň zůstali optimističtí, že se závěry budou zlepšovat s přibývajícími referenčními daty.

“Inherited Defects in Pedigree Dogs. Část 2: Poruchy, které nesouvisejí se standardy plemene.” 2010. The Veterinary Journal 183 (1). W.B. Saunders:39-45.

Larson, Greger a Dorian Q. Fuller. 2014. “Evoluce domestikace zvířat”. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 45 (1):115-36.

Larson, Greger, Elinor K. Karlsson, Angela Perri, Matthew T. Webster, Simon Y. W. Ho, Joris Peters, Peter W. Stahl a další. 2012. “Přehodnocení domestikace psů integrací genetiky, archeologie a biogeografie”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (23):8878-83.

Li, Yan, Dong-Dong Wu, Adam R. Boyko, Guo-Dong Wang, Shi-Fang Wu, David M. Irwin a Ya-Ping Zhang. 2014. “Populační variabilita odhalila vysokohorskou adaptaci tibetských mastifů”. Molekulární biologie a evoluce 31 (5):1200-1205.