Ammoniumacetatbuffere kan forårsage forskellige problemer i laboratoriet. To almindelige problemer omfatter overraskende stigninger i HPLC-MS-bagtrykket ved opstart af instrumentet efter opbevaring natten over og vanskeligheder med MS-følsomheden.
Stigning i instrumentets bagtryk ved brug af ammoniumacetat (og ammoniumformiat) er et almindeligt problem, der er fundet på kromatografifora, især når instrumentet har stået natten over eller ved de første kørsler hver dag. Højopløselige vandige buffere kan give anledning til en hel del hovedbrud. De bliver problematiske i praktisk brug, idet de blokerer kapillærer, forkolonner og analytiske kolonneende fritter.
Disse problemer skyldes uvægerligt en misforståelse af bufferopløseligheden i blandede organiske vandige medier. Dette kan afhjælpes ved hjælp af de data, der er vist i figur 1.
Figur 1: Opløseligheden af fem buffere i blandinger med acetonitril. (Tilpasset med tilladelse fra Ref. 1)
Figur 1 viser tydeligt, at opløseligheden af ammoniumacetat i binære blandinger, der indeholder over 90 % acetonitril, bliver stadig mere begrænset i opløselighed og helt uopløseligt i 100 % acetonitril. Mens 20 mM ammoniumacetat er opløselighedsgrænsen ved 90 % acetonitril, falder denne grænse kraftigt til 10 mM ammoniumacetat (en populær bufferkoncentration, der anvendes ved LC-MS-applikationer) ved 95 % acetonitril-blandinger. Overskridelse af disse opløselighedsgrænser resulterer i en grumset væske på grund af den fine ammoniumacetatudfældning i opløsningen. Dette kan blokere kapillærer og kolonnefritter og forårsage en stigning i systemets modtryk. Det skal også bemærkes, at dataene fra figur 1 er udledt ved anvendelse af en buffer af høj kvalitet – opløseligheden vil falde, hvis der anvendes buffersaltreagenser af lavere kvalitet (renhed). Man bør undgå at forsøge at opløse ammoniumacetat i ren acetonitril, selv om opløsningen så kan være tilsat vand. Selv om det i første omgang kan se ud til, at bufferen er opløselig, vil den hurtigt falde ud af opløsningen (figur 2).
Figur 2: Ammoniumacetatrest, der dannes ved “opløsning” af ammoniumacetat i acetonitril, efterfulgt af tilsætning af vand for at opnå det krævede organiske/vandige forhold i eluenten (Foto venligst udlånt af dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK).
I en typisk reversed phase HPLC-gradient er dette måske ikke så meget af et problem, medmindre gradienten naturligvis går til >90% acetonitril. Der er imidlertid andre overvejelser, f.eks. de relative procentdele af organisk opløsningsmiddel, som den vandige buffer kan støde på, når der blandes ved hjælp af lav- eller højtryksblandingssystemer, når der injiceres prøver opløst i høje procentdele acetonitril eller, i værste fald, når systemer skylles med 100 % acetonitril for at fjerne kolonneforureninger eller til opbevaring natten over.
Der er yderligere den betragtning, at der ved brug af 100 % acetonitril til kolonneopbevaring kan forekomme store pH-skift i 100 % organisk opløsningsmiddel, og man skal være opmærksom på, om disse pH-skift kan bringe kolonneopbevaringens pH-værdi ind i et område, hvor opløsning af silica-matrixen kan være mulig, hvilket fører til dannelse af “fines” i kolonnen, som i sidste ende vil resultere i kolonneblokeringer (ved høj pH) eller stripping af de bundne faseligander (ved lav pH).
Ammoniumacetat som buffer
Mange har valgt at bruge ammoniumacetat som buffer, især når der anvendes MS-detektion, på grund af dets iboende flygtighed og lave tilbøjelighed til API-kildekontaminering. Vi skal dog være opmærksomme på denne begrænsede opløselighed og justere vores HPLC-praksis i overensstemmelse hermed. Forstå, om brugen af ammoniumacetat er passende for forsøget, og om en buffer faktisk er nødvendig. Kravene til brug og det passende valg og den passende koncentration af en buffer er ofte misforstået. Ammoniumacetat er et eksempel til undersøgelse af brugen og misbruget af dette meget elskede buffersystem.
Buffere er nødvendige for at modstå små ændringer i pH (primært i eluenten) og for at sikre, at HPLC-søjlen forbliver i en tilstand af konstant ladning (primært ioniseringstilstanden af resterende silanolarter på silica-substraternes overflade). Ændringer i pH kan medføre problemer med retentionstidsstabilitet, peakform og (ved anvendelse af Electrospray MS) instrumentets følsomhed. Typisk vil den største “udfordring” for systemets pH-værdi komme fra blandingen af prøvefortyndingsmidlet med eluenten i de forbindende komponenter mellem injektoren og HPLC-kolonnen (eller førkolonnen) og ved kolonnens hoved. Hvis prøvefortyndingsmidlet har en anden pH-værdi, kan analysanden (eller en del af analysemolekylerne) ændre ioniseringstilstand og kromatografere anderledes eller reagere anderledes i MS-grænsefladen som følge heraf. Det er imidlertid vigtigt at forstå kemien i vores analysemetode for at kunne foretage kritiske valg af buffertype og -koncentration. Analysandekoncentrationerne og mængden af kolonneoverflade, der kræver pH-kontrol, er så lave, at der kun er behov for en meget lav koncentration af buffer for at opretholde reproducerbare retentionstider, acceptabel topform og detektionsfølsomhed.
Figur 3 viser de situationer, hvor ammoniumacetat kan være til brug i både kromatografi og massespektrometri.
Figur 3: Variation af bufferkapacitet for vandig ammoniumacetatopløsning (10mM) med forskellige andele acetonitril (%) (Tilpasset med tilladelse fra Ref. 2)
Væsentligt er der to bufferområder, når 10mM ammoniumacetat tilsættes til vores eluentopløsning, og enten fortyndet ammoniak eller myresyre anvendes til at justere pH-værdien. Uden tilsætning af syren eller basen vil opløsningen have en meget lille bufferkapacitet.
I 100 % vandig opløsning ligger pKa-værdierne for buffere omkring 4,8 og 9,5. Bufferen anvendes bedst omkring +/- 1 pH-enhed fra bufferens pKa-værdi, hvor bufferkapaciteten vil blive reduceret til ca. 66 %. Ved en afstand på 2 pH-enheder fra buffer-pKa-værdien reduceres bufferkapaciteten til ca. 5 %. For en ammoniumacetatbuffer i vand bør den eluente pH-værdi, der anvendes til separation, være 3,8 til 5,8, når der anvendes myresyre som pH-modifikator, og 8,5 til 10,5, når der anvendes ammoniak til justering af eluentens pH-værdi. Forbeholdet: Når acetonitril tilsættes systemet, ændres dette arbejdsområde, og det anvendelige pH-område bliver 5,2 til 7,2 eller 7,9 til 9,9 ved 60 % acetonitril. Ved gradientseparationer ændres buffersystemets pKa konstant. Systemets pKa ved gradientens startsammensætning anvendes til at vurdere bufferens anvendelighed til separationen.
Vil disse pH-områder være tilstrækkelige til at undgå ændringer i omfanget af ionisering af analysanden eller protoneringsændringer i kolonnen? Det er det centrale spørgsmål.
For MS-detektion vil ionogene analytter i den ioniserede form resultere i god detektionsfølsomhed, samtidig med at omvendt fase-retention styres gennem et fornuftigt valg af stationær fase og organisk opløsningsmiddel type og sammensætning. Hvis analysanden er fuldt ioniseret ved de pH-områder, der er foreslået ovenfor (og i figur 3), vil det give gode kromatografiske og detektionsresultater. Det fremgår af figur 1, at systemets bufferkapacitet mindskes, efterhånden som der tilsættes acetonitril, idet bufferkapaciteten falder til 30 % af den vandige værdi ved 60 % acetonitril. Hovedprincippet ved brug af buffer i LC-MS er at bruge så lidt som muligt for at bevare retentionstidsreproducerbarheden, en acceptabel topform og detektorfølsomhed. Koncentrationen af buffer har direkte indflydelse på mængden af ionundertrykkelse, og derfor vil metodens følsomhed blive direkte påvirket. For at opretholde en god bufferkapacitet ved lavere bufferkoncentrationer tilstræber vi ofte at arbejde inden for +/- 0,5 enheder af bufferens pKa.
Tabel 1 viser de anbefalede pH-områder, inden for hvilke ammoniumacetatbuffere vil være nyttige.
| % MeCN | Maximalt bufferkapacitetsområde (eddikesyre/acetat) | Maximalt bufferkapacitetsområde (ammonium/ammoniak) | Bufferkapacitet (% i forhold til 100 % Aq-opløsning) | |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 | |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 | |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 | |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 | 30 |
Tabel 1: Anbefalede pH-arbejdsområder og vejledende relative bufferkapaciteter for 0,1 mM ammoniumacetat (aq) / acetonitril eluentsystemer.
Brug bufferområderne fra tabel 1 til at vælge den eluent-pH-værdi, hvor analysanden skal ioniseres 100 %. Bemærk, at den bufferkoncentration, der er anvendt til at udlede disse tal, er 0,1 mM – et populært valg af bufferkoncentration, når der anvendes MS-detektion. For basiske analyter er eddikesyre/acetat-buffersystemet almindeligt, og eluent-pH-værdien er normalt et godt stykke under pKa-værdien for de basiske analyter, hvilket sikrer, at de konstant protoneres. Det samme kan gælde for sure analyter med ammonium/ammoniak-systemet, hvor sure analyter alle skal være fuldt deprotonerede. Dette vil sikre, at retentionstiderne er stabile, at topformerne er sunde, og at MS-følsomheden optimeres ud fra et metodekemisk perspektiv.
Der er store huller i de effektive bufferintervaller for ammoniumacetatbaserede eluenter. Det vil sige, at ved en 20 % acetrontril eluentsammensætning (eller en startgradientsammensætning på 20 % acetonitril) vil der sandsynligvis være en lavere bufferkapacitet (der skal anvendes højere bufferkoncentrationer) med en eluent pH under 4,2, mellem pH 5,2 og 9,0 eller over 10,0. Der findes andre metoder, hvor eluentens pH-værdi justeres uden for disse anbefalede intervaller, når der anvendes ammoniumacetatbuffere. Overvej at anvende et andet buffersystem – formate/myresyresyresystemet er et populært valg ved eluent pH-værdier under 4,2.
Bør der altid anvendes en buffer?
Hvis eluent pH er langt fra analyttens pKa, vil små ændringer i eluent pH have en ubetydelig virkning på graden af ionisering af analytten. Under disse omstændigheder kan det være unødvendigt at anvende en buffer. Eksempelvis har eddikesyre (såvel som myresyre, trifluor- og difluoreddikesyre) en betydelig “selvbufferingskapacitet” ved lav pH og giver den basiske analysand pKa >2 pH-enheder højere og den sure analysand pKa
Dette er alt sammen under forudsætning af, at basiske analytter analyseres med et surt eluentsystem og sure analytter med et mere basisk eluentsystems pH for at sikre fuld ionisering og god elektrospray MS-følsomhed. Hvis man oplever problemer med instrumentets modtryk, ustabilitet i retentionstiden eller MS-detektionsfølsomhed, kan det godt være værd at overveje, om der overhovedet er behov for et buffersalt. En fornuftig anvendelse af myresyre- eller eddikesyre eller ammoniakopløsning kan meget vel løse eventuelle problemer.
Uanset hvad der er tilfældet, skal du tage dig tid til at forstå metodens kemi med hensyn til din analyt pKa, den krævede eluent pH og valget af buffersystem, der anvendes til at opnå og opretholde denne pH i systemet.
For dem, der ikke har oplysninger om analyt pKa, er der en række gratis programmer til rådighed, som gør et rimeligt stykke arbejde med at forudsige analyt pKa på grundlag af strukturen. De mest anvendte i vores laboratorier er:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Hvis du søger en dybere forståelse af buffere og deres anvendelse inden for HPLC og LC-MS, henvises til artiklerne i referencerne 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger og Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part I – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019