3.1 Endogene fiskeenzymer

Som nævnt ovenfor findes forskellige proteolytiske enzymer i indvolde, fordøjelseskanalen og muskelvæv hos fisk.

De vigtigste endogene proteinaser i ansjoser var trypsinlignende proteinase, pepsin, chymotrypsin, elastase og aminopeptidase (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Fordøjelsesenzymerne trypsin, chymotrypsin og pepsin anses for at være de tre vigtigste enzymer i forhold til andre (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsin findes normalt i fiskens mave og er et af de vigtigste enzymer i fordøjelsessaften (de la Parra et al., 2007). Trypsin er til stede i indvolde, pyloric caeca og milt (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Hepatopancreas af fisk og skaldyrs fordøjelsesorganer indeholder både peptidase- og proteinaseaktiviteter såsom aminopeptidase, gelatinolytiske proteaser, trypsin og chymotrypsin og kollagenolytiske proteaser (Sriket, 2014).

Det blev fundet, at de fleste lipolyse- og proteolyseaktiviteter ved peda-forarbejdning blev registreret i tarmen, især i begyndelsen af fermenteringsprocessen; aktiviteterne faldt dog hurtigt i løbet af processen (Irianto, 1990). I betragtning af at enzymer findes i indvoldene og fordøjelseskanalen, spiller udtagningen en vigtig rolle i forhold til at bestemme hastigheden og typen af enzymatisk nedbrydning, der finder sted. Fermenterede fiskeprodukter, der er fremstillet af hele fisk, vil have andre karakteristika end dem, der er fremstillet af fisk uden hoved og renset (Wheaton & Lawson, 1985). Den enzymatiske aktivitet af de fleste viscerale og fordøjelseskanalenzymer fra fisk havde den største aktivitet ved næsten neutrale pH-værdier (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).

Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño og Toro (2004) isolerede et surt proteolytisk enzym, som tilhører den aspartiske proteaseklasse, fra indvolde fra sardiner. Enzymet ligner pepsin II fra andre fiskearter og er stabilt ved pH 3-6 og 45°C.

Den pyloriske caeca udgør de organer, der er den største kilde til alkaliske proteinaser. Et trypsinlignende enzym fremstillet fra pyloric caeca fra torsk (G. morhua) havde et isoelektrisk punkt på 5,30 og 5,89 og lignede meget i aminosyresammensætning kvægtrypsin, men adskilte sig ved at have en højere relativ mængde af sure aminosyrer og en lavere mængde af basiske aminosyrer. Enzymet hydrolyserede også fiskeproteinsubstrater (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).

Tre alkaliske proteinaser og to syreproteinaser blev isoleret fra sardin. Hver af de alkaliske proteinaser hydrolyserede kasein hurtigere end andre proteiner. En vigtig alkalisk proteinase (III) hydrolyserede sarkoplasmatiske proteiner fra sardin fem gange hurtigere end andre alkaliske proteinaser. Hver af de to sure proteinaser hydrolyserede hæmoglobin og myoglobin hurtigere end de andre proteiner. Efter præinkubation med 25 % NaCl var en alkalisk proteinase (III) og en sur proteinase (II) stabile, mens de andre proteinaser blev ustabile. De to proteinaser, alkalisk proteinase III og sur proteinase II, var også stabile i 3 måneder efter påbegyndelsen af produktionen af fiskesovs. Den proteolytiske aktivitet af hver af de alkaliske og de sure proteinaser blev stærkt hæmmet af mere end 15 % NaCl; der blev dog observeret en minimal hæmning, når sardinemuskelproteiner blev anvendt som substrat (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).

To aminopeptidaser (I og II) blev ekstraheret fra affedtede indre organer af sardin og oprenset ved hjælp af DEAE-cellulosekromatografi, gelfiltrering på Sephadex G-200 og isoelektrisk fokusering. De endelige præparater af enzymer I og II blev vurderet som næsten homogene ved polyacrylamidgelelektroforese. Molekylvægten af enzymerne I og II blev ved gelfiltrering bestemt til henholdsvis 370.000 og 320.000. De isoelektriske punkter var henholdsvis 4,1 (I) og 4,8 (II). Begge enzymer blev hæmmet af EDTA og aktiveret af Co++. Bestatin kunne hæmme enzym I, men ikke enzym II. Enzymerne I og II hydrolyserede hurtigt ikke kun syntetiske substrater indeholdende alanin eller leucin, men også di-, tri- og tetra-alanin. På grundlag af alle disse egenskaber ligner sardinaminopeptidaser menneskelig alaninaminopeptidase. Enzym I beholdt mere end 70 % af sin oprindelige aktivitet i 15 % NaCl, hvilket tyder på, at enzymet deltager i hydrolyseringen af fiskeproteiner og peptider under fremstillingen af fiskesovs (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).

Aktiviteterne af alkaliske og sure proteinaser blev sammenlignet med bovin trypsin og pepsin og viste, at ligesom bovin trypsin hydrolyserede den alkaliske proteinase fra sardiner pyloric caecaeca kasein mere effektivt end andre proteinsubstrater (Noda et al, 1982).

Muskelvævsenzymer, især cathepsiner, peptidaser, transaminaser, amidaser, aminosyre-decarboxylaser, glutamidehydrogenaser og beslægtede enzymer, findes alle i fiskemuskelvæv (Chaveesuk, 1991), og disse enzymer, især trypsin, chymotrypsin og cathepsin, er involveret i proteinhydrolysen under fiskesovsfermentering (Fernandes, 2016). Muskelvævets enzymer er for det meste placeret i cellerne. På den anden side er fordøjelsesenzymer exocellulære sekretioner. Selv om nogle undersøgelser viste, at muskelvævsenzymer har en optimal aktivitet ved neutral pH, oplyser de fleste rapporter, at lave pH-værdier fremskynder muskelvævsenzymaktiviteterne. De fleste fermenterede fiskeprodukter forarbejdes ved en pH-værdi på over 4, bortset fra fiskeensilage og visse fermenterede fiskeprodukter. Følgelig er de fleste muskelvævsenzymer faktisk ikke ved optimal pH-tilstand (Mackie et al., 1971).

Den delvise karakterisering af kathepsin B fra hestemakrelens muskel viste lignende egenskaber som andre kathepsin BS. Den optimale pH-værdi for kathepsinet var 5 med en optimal temperatur på 50°C. Aktiviteten blev hæmmet af E-64, CA-074 og chymostatin (Yoshida et al., 2015).

Maximale enzymaktiviteter kan opnås ved at anvende hele fisk, herunder hoveder og indvolde. Derimod vil der forekomme minimal enzymaktivitet, når der anvendes fisk uden hoved og indvolde til fremstilling af fermenterede fiskeprodukter. I mellemtiden kan der opnås mellemliggende enzymaktiviteter ved at fjerne indvoldene på et hvilket som helst tidspunkt, efter at fisken er fanget, for at tillade en visdiffusion af viscerale enzymer i vævene (Owens & Mendoza, 1985).

I saltet fisk beskrives modningen ved hjælp af tre hypoteser. Disse er (1) mikrobiologisk teori, (2) autolytisk teori og (3) enzymteori. Ifølge den mikrobiologiske teori producerer mikroorganismerne de essentielle aktive enzymer, og disse enzymer trænger ind i kødet og bidrager til modningsprocessen. Den autolytiske teori beskriver, at modningen er et resultat af aktiviteten af enzymer i musklerne eller andre væv eller i mave-tarmkanalen. Endelig forklarer enzymteorien, at modningen af saltet fisk sker under indflydelse af visse enzymer, nemlig dem, der findes i muskelvævet, dem, der findes i fiskens tarmorganer, sammen med dem, der produceres af mikroorganismer (Mackie et al., 1971).

I forbindelse med modning af ansjoser blev der fundet maksimal autolytisk aktivitet hos indisk ansjos (Stolephorus indicus) ved 60°C. Den autolytiske aktivitet faldt med øget NaCl-koncentration. Råekstrakt udviste en optimal pH ved 8,5-9,5. Trypsinlignende proteinaser var de fremherskende proteinaser i råekstraktet. Proteinaser fra indisk ansjos kunne deltage i proteinhydrolysen under fermentering af fiskesovs. Derfor kan inkubation af indisk ansjos ved 60 °C og i 10 % NaCl i en periode før fuld saltning ved 25 % NaCl være en effektiv metode til at fremskynde fermenteringsprocessen af fiskesovs (Siringan et al., 2006).