2.25.2.3.2(iv) Fælles mål i forskellige hjernecelletyper

Calcium homeostase og calciumafhængig kinase cellesignalering er de mest almindelige ledende mål i alle hjernecelletyper. Selv om divalente calciumioner (Ca2+) og divalente blyioner (Pb2+) har forskellige kemiske egenskaber, hvor calciumioner foretrækker iltbinding og blyioner foretrækker svovlbinding, har virkningerne af bly på calciumhomeostase og calciummedieret cellesignalering fortrinsvis været fokuseret i historien om blyforgiftning (f.eks. osteoporose ved blyforgiftning og proteinkinase C (PKC)-signaliseringsveje) (Goldstein 1993; Pounds et al. 1991). Identifikationen af bly, der er stærkt bundet til GRP78, et cysteinfattigt protein (Qian et al. 2000), tyder på, at bly også kan være rettet mod ikke-sulfhydrylrige proteiner. GRP78 er et glutaminsyre- og asparaginsyre-rigt calciumbindende protein (17,2 % glutaminsyre og asparaginsyre i forhold til gennemsnittet på 11,7 %) (Klapper 1977), og det befinder sig i ER og bidrager til calciumbuffering i ER, en vigtig organel for calciumlagring (Macer og Koch 1988). Blybinding til GRP78 giver yderligere stærke beviser for, at blyforstyrret calciumhomeostase og calciumafhængig cellesignalering spiller en vigtig rolle for bly neurotoksicitet.

Den betydning, som calcium har for cellesignalering, er velkendt. Calcium spiller betydelige roller i neuronal differentiering, vækst, forgrening, migration, strukturel organisering, synapse-dannelse og synaptisk plasticitet (Braun og Schulman 1995). Betydningen af kalciumsignalering er også dokumenteret i kommunikationen mellem astroglia og mellem astroglia og neuroner (Scemes og Giaume 2006). Direkte eller indirekte calciumafhængige proteiner og enzymer er involveret i mange cellesignalveje, og calciumhomeostase er også involveret i apoptose i nervesystemet (Alberdi et al. 2005; Polster og Fiskum 2004). Calciumafhængig cellesignalering reguleres af ændringer i den intracellulære koncentration af frie calciumioner gennem calciumkanaler (f.eks. spændingsafhængige calciumkanaler (VGCC’er)) eller pumper (f.eks. Ca2+-ATPase-pumpen) på plasmamembranen eller intracellulære lagre (f.eks. ER og mitokondrier). Omvendt regulerer fosforylerings-/affosforyleringscyklusser af calciumkanaler (f.eks. VGCC- og NMDA-receptorkanaler), som reguleres af calciumafhængige kinaser/fosfataser, også de intracellulære calciumkoncentrationer (Lieberman og Mody 1994; Raman et al. 1996). Neurotoksiske stoffer, herunder bly, kan således påvirke calciumhomeostasen på mange måder, hvilket vil resultere i ændringer i cellesignaleringen. Dette emne er blevet gennemgået i detaljer (Audesirk og Tjalkens 2004), og derfor vil dette afsnit fokusere på almindelige mål for calciumafhængige proteiner eller enzymer og andre potentielle fælles mål.

PKC er en calciummedieret proteinkinase, der er involveret i cellesignalering i alle hjernecelletyper (Braun og Schulman 1995). Bly stimulerer diacylglycerol-aktiveret calcium- og fosfolipidafhængig PKC, der er delvist oprenset fra rottehjerne, og picomolære koncentrationer af bly viste sig at være ækvivalente med mikromolære koncentrationer af calcium i PKC-aktivering (Long et al. 1994; Markovac og Goldstein 1988). Dette regulerende enzym kan altså registrere blyniveauer, der kan forventes i forbindelse med nuværende miljøeksponeringer på lavt niveau. Selv om det meste af det bly, der findes i hjernen, aflejres i astroglia, er det muligt, at bly nok kan nå frem til neuroner og andre hjernecelletyper til at modulere PKC-aktiviteten. Undersøgelser fra PC12-celler viste, at blyniveauer på helt ned til 10 nmol l-1 øgede PKC-aktiviteten, mens niveauer på eller over 10 μmol l-1 mindskede PKC-aktiviteten. Tilstedeværelsen af glutamat på 500 μmol l-1 forværrede den blyinducerede celledød, og dette kunne delvist blokeres af 100 nmol l-1 staurosporin, en PKC-hæmmer, eller 1 μmol l-1 MK-801, en NMDA-antagonist (Jadhav et al. 2000). Lignende resultater blev også observeret i andre undersøgelser, der viste, at bly på 0,53 μmol l-1 øgede PKC-aktiviteten med 200 % efter 2 timer, hvorefter aktiviteten vendte tilbage til kontrolniveauet efter 48 timer (Tian et al. 2000). Betydningen af blyaktiveret PKC-aktivitet er blevet knyttet til neuronal differentiering. Undersøgelser af dyrkede hippocampale neuroner fra rotter rapporterede, at inhibering af PKC med calphostin C forværrede hæmningen af neuritinitiering forårsaget af 100 nmol l-1 af blychlorid (Kern og Audesirk 1995), hvilket tyder på en involvering af PKC i blyneurotoksicitet. I modsætning til denne undersøgelse stimulerede bly på 25-100 nmol l-1 NGF-induceret neuritudvækst i PC12-celler, og det blev konstateret, at aktivering af ekstracellulær signalreguleret proteinkinase (ERK) var involveret i bly-stimuleringen (Crumpton et al. 2001; Williams et al. 2000a). Disse modsatrettede resultater afspejler således den kompleksitet, der opstår som følge af tilstedeværelsen af flere neuritinitieringsveje og flere mål for blyforgiftning i nervesystemet. Tyrosinhydroxylase (TH) er en udviklingsmarkør for neuronal differentiering, og dens aktivitet reguleres af PKC. PKC-hæmmeren Ro32-0342 undertrykte blyinduceret TH-aktivitet i PC12-celler (Tian et al. 2000). ODC er et centralt regulerende enzym i polyaminvejen, der er involveret i talrige metaboliske processer i det udviklende og modne nervesystem. I neocortex og cerebellum hos rotteunger, der under laktationen blev udsat for bly gennem moderens drikkevand (0,2 % blyacetat) fra fødslen til fravænning, dæmpede blyeksponering både ODC- og PKC-aktiviteterne fra PND 3 til PND 30. Undersøgelser i PC12-celler tydede på, at svækkelsen af ODC ved bly skyldtes blysvækket PKC-aktivitet, fordi NGF-induceret ODC-aktivitet blev svækket af PKC-hæmmeren staurosporin (Hilliard et al. 1999). PKC-aktivitet var også involveret i blyinduceret transkriptionsfaktor Sp1 DNA-bindingsaktivitet, fordi PKC-hæmmeren staurosporin mindskede blyinduceret Sp1 DNA-binding i PC12-celler, hvilket blev understøttet af fundet af, at Sp1 DNA-bindingsaktivitet blev moduleret parallelt med PKC-aktivitet i hippocampus hos blyeksponerede rotter (Atkins et al. 2003). Sp1 menes også at være involveret i NMDA-receptor-genekspression (Bai og Kusiak 1995). PKC-afhængig Sp1 DNA-binding bør spille en vigtig rolle i blymoduleret NMDA-receptorekspression, selv om der er rapporteret kontroversielle resultater fra forskellige forskningsgrupper (Cory-Slechta et al. 1997a,b; Guilarte et al. 1993; Lasley et al. 2001; Ma et al. 1997).

Undersøgelser har vist, at PKC-aktivering var involveret i blyinduceret forsinkelse af oligodendrogliogenese. Blyinduceret nedsættelse af proliferation og differentiering i dyrkede rotte-OP’er blev ophævet ved hæmning af PKC med bisindolylmaleimid I, mens virkningen af det PKC-aktiverende middel phorbol-12,13-didecanoat blev potenseret af bly. Bly forårsagede også translokation af PKC fra cytoplasmaet til membranrummet uden en stigning i den samlede cellulære PKC-aktivitet (Deng og Poretz 2002). Sp1 kan regulere genekspressionen af MBP og PLP, to vigtige strukturelle bestanddele af myelin i centralnervesystemet (Henson et al. 1992; Tretiakova et al. 1999). Således er det rimeligt at formode, at PKC-afhængig Sp1 DNA-bindingsaktivitet er involveret i de blyinducerede ændringer af udviklingsprofilerne af PLP og MBP (Zawia og Harry 1995).

Men selv om der ikke foreligger direkte beviser for, at PKC-afhængig Sp1 DNA-bindingsaktivitet var involveret i HSP70-, HSP90- og GRP78-genekspression, der reguleres af bly i astroglia (Opanashuk og Finkelstein 1995; Qian et al. 2000, 2001; Selvin-Testa et al. 1997), implicerer involveringen af Sp1 og PKC i HSP70-, HSP90- og GRP78-genekspressionen (Jacquier-Sarlin et al. 1995; Rebbe et al. 1989; Song et al. 2001; Ting og Lee 1988), at bly kan modulere ekspressionen af disse gener gennem PKC-afhængig Sp1 DNA-bindingsregulering. En korrelation mellem PKC- og GFAP-ekspression blev profileret i astrogliale cellelinjer (Brodie et al. 1998; Masliah et al. 1991). Det er imidlertid endnu ikke blevet verificeret, om blyinduceret GFAP-overekspression blev formidlet gennem PKC (Harry et al. 1996; Selvin-Testa et al. 1994; Stoltenburg-Didinger et al. 1996; Waterman et al. 1994). Menneskelige undersøgelser af blyarbejdere støttede betydningen af blymoduleret PKC-aktivitet i forbindelse med blyneurotoksicitet, fordi bly i skinnebenet og eksponeringsvarigheden var signifikant forbundet med erythrocyt-PCC-aktivering (Hwang et al. 2001). Sammenfattende medierer PKC sandsynligvis mange aspekter af blyinduceret neurotoksicitet i nervesystemet.

Den δ-aminolevulinsyre dehydratase (ALAD) er et nøgleenzym, der katalyserer omdannelsen af δ-aminolevulinsyre (δ-ALA) til porphobilinogen i den biosyntetiske hæmvej. ALAD er et velkendt molekylært mål for blyeksponering, og dets aktivitet hæmmes med 50 %, når blyindholdet i blodet overstiger 20 μg dl-1. Blyinduceret ALAD-hæmning resulterer i et øget cirkulerende ALA-niveau. ALAD-aktivitet i blodet og δ-ALA-niveauet i urinen anvendes derfor til at diagnosticere blyforgiftning hos voksne med et blyindhold i blodet på over 35 μg dl-1 og hos børn med et blyindhold på 25-75 μg dl-1. Desuden nedsætter det øgede cirkulerende ALA-niveau GABA-frigivelse i centralnervesystemet, hvilket forårsager blyneurotoksicitet (Patrick 2006b). Selv om inhiberingen af ALAD ved blyeksponering er identificeret i erytrocytter, udtrykkes ALAD i alle væv, herunder hjernevæv, og hæm er afgørende for biosyntesen af cytokromer, der er nødvendige for ATP-produktion i mitokondrierne. Desuden har CysCysHisCysCys-zinkbindingsmotivet i ALAD en meget højere affinitet for bly med en molær absorptionsaktivitet på 16 000 mol-1 cm-1, hvilket er betydeligt højere end det mest almindelige zinkfingermotiv, CysCysHisHis, med en molær absorptionsaktivitet på 700 mol-1 cm-1 i andre proteiner eller enzymer (Godwin 2001). Det kan derfor forventes, at bly hæmmer ALAD-aktiviteten i hjernevæv, hvilket fører til neurotoksicitet i centralnervesystemet.