AFLATOXINER : Forekomst og sundhedsrisici

Aflatoksiner er giftige metabolitter, der produceres af visse svampe i/på fødevarer og foderstoffer. De er sandsynligvis de mest kendte og mest intensivt undersøgte mykotoksiner i verden. Aflatoksiner er blevet sat i forbindelse med forskellige sygdomme, såsom aflatoksicose, hos husdyr, husdyr og mennesker i hele verden. Forekomsten af aflatoksiner påvirkes af visse miljøfaktorer; forureningsgraden varierer derfor med den geografiske beliggenhed, landbrugs- og agronomiske praksis og varernes modtagelighed for svampeinvasion i perioden før høst, lagring og/eller forarbejdning. Aflatoksiner har fået større opmærksomhed end nogen anden mykotoksin på grund af deres påviste potentielt kræftfremkaldende virkning hos modtagelige forsøgsdyr og deres akutte toksikologiske virkninger hos mennesker. Da man er klar over, at der aldrig kan opnås absolut sikkerhed, har mange lande forsøgt at begrænse eksponeringen for aflatoksiner ved at indføre lovbestemte grænseværdier for varer, der er beregnet til anvendelse som fødevarer og foder.

Indledning

I 1960 døde mere end 100 000 unge kalkuner på fjerkræfarme i England i løbet af få måneder af en tilsyneladende ny sygdom, der blev kaldt “Turkey X disease” . Det viste sig hurtigt, at problemet ikke var begrænset til kalkuner . Ællinger og unge fasaner blev også ramt, og der var stor dødelighed.

En omhyggelig undersøgelse af de første udbrud viste, at de alle var forbundet med foder, nemlig brasiliansk jordnøddemel. Der blev foretaget en intensiv undersøgelse af det mistænkte jordnøddemel, og det blev hurtigt konstateret, at dette jordnøddemel var meget giftigt for fjerkræ og ællinger med symptomer, der var typiske for Turkey X disease.

Spekulationer, der blev foretaget i 1960 om toksinets art, tydede på, at det kunne være af svampeoprindelse. Den toksinproducerende svamp blev faktisk identificeret som Aspergillus flavus (1961), og toksinet fik navnet Aflatoxin på grund af sin oprindelse (A.flavis–>Afla).

Denne opdagelse har ført til en voksende bevidsthed om de potentielle farer ved disse stoffer som forurenende stoffer i fødevarer og foder, der kan forårsage sygdom og endog døden hos mennesker og andre pattedyr. Undersøgelser, der er opsummeret i de følgende afsnit, viste, at aflatoksiner primært produceres af nogle stammer af A. Flavus og af de fleste, om ikke alle stammer af A. parasiticus samt af beslægtede arter, A. nomius og A. niger. Desuden viste disse undersøgelser også, at der findes fire store aflatoksiner: B1, B2, G1 og G2 samt to yderligere metaboliske produkter, M1 og M2, som er af betydning som direkte forurenende stoffer i fødevarer og foder. Aflatoksinerne M1 og M2 blev først isoleret fra mælk fra lakterende dyr, der blev fodret med aflatoksinpræparater; deraf betegnelsen M. B-betegnelsen for aflatoksinerne B1 og B2 skyldes, at de udviser blå fluorescens under UV-lys, mens G-betegnelsen henviser til den gulgrønne fluorescens af de relevante strukturer under UV-lys. Disse toksiner har meget ensartede strukturer og udgør en unik gruppe af stærkt oxygenerede, naturligt forekommende heterocykliske forbindelser. Deres molekylformler, som er fastlagt på grundlag af elementære analyser og massespektrometriske bestemmelser, er:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Aflatoksiner B2 og G2 blev fastlagt som dihydroxidderivater af henholdsvis B1 og G1. Aflatoksin M1 er 4-hydroxyaflatoksin B1, og aflatoksin M2 er 4-dihydroxyaflatoksin B2.

Forekomst

I rå landbrugsprodukter :

Aflatoksiner forekommer ofte i afgrøder i marken før høst. Kontaminering efter høst kan forekomme, hvis tørringen af afgrøderne forsinkes, og under opbevaring af afgrøderne, hvis vandet får lov til at overstige de kritiske værdier for skimmelvækst. Insekt- eller gnaverangreb letter skimmelinvasionen af visse oplagrede varer.

Aflatoksiner påvises lejlighedsvis i mælk, ost, majs, jordnødder, bomuldsfrø, nødder, mandler, figner, krydderier og en række andre fødevarer og foderstoffer . Mælk, æg og kødprodukter er undertiden forurenede, fordi dyrene har spist aflatoksinforurenet foder . De råvarer med den største risiko for aflatoksinforurening er dog majs, jordnødder og bomuldsfrø.

I forarbejdede fødevarer :

Majs er sandsynligvis den vare, der giver anledning til størst bekymring i hele verden, fordi den dyrkes i klimaer, hvor der er sandsynlighed for vedvarende forurening med aflatoksiner, og fordi majs er grundfødevare i mange lande. De procedurer, der anvendes ved forarbejdning af majs, bidrager imidlertid til at reducere kontamineringen af det resulterende fødevareprodukt. Det skyldes, at selv om aflatoksiner er stabile til moderat stabile i de fleste fødevareprocesser, er de ustabile i processer som f.eks. de processer, der anvendes til fremstilling af tortillaer, hvor der anvendes alkaliske forhold eller oxiderende trin. Aflatoksinforurenet majs- og bomuldsfrømel i mælkerationerne har resulteret i aflatoksin M1-forurenet mælk og mælkeprodukter, herunder fedtfri tørmælk, ost og yoghurt.

Faktorer, der fremmer produktionen af aflatoksin

Svampevækst og aflatoksinforurening er en følge af interaktioner mellem svampen, værten og miljøet. Den rette kombination af disse faktorer er afgørende for angrebet og koloniseringen af substratet og for typen og mængden af aflatoksin, der produceres. Et egnet substrat er imidlertid nødvendigt for svampens vækst og den efterfølgende toksinproduktion, selv om man ikke helt præcist ved, hvilken(n) faktor(er) der udløser toksindannelsen. Vandstress, stress ved høj temperatur og insektskader på værtsplanten er vigtige faktorer, der er afgørende for skimmelangreb og toksinproduktion . På samme måde er specifikke vækststadier i afgrøderne, dårlig frugtbarhed, høj afgrødetæthed og ukrudtskonkurrence blevet forbundet med øget vækst af skimmel og toksinproduktion. Aflatoxindannelsen påvirkes også af den tilknyttede vækst af andre skimmelsvampe eller mikrober . F.eks. fremmes aflatoksinforurening af jordnødder og majs før høst af høje temperaturer, langvarig tørke og høj insektaktivitet, mens produktion af aflatoksiner på majs og jordnødder efter høst fremmes af varme temperaturer og høj luftfugtighed.

Aflatoksicose og dyresundhed

Aflatoxicose er primært en leversygdom. De enkelte dyrs modtagelighed for aflatoksiner varierer betydeligt afhængig af art, alder, køn og ernæring. Faktisk forårsager aflatoksiner leverskader, nedsat mælke- og ægproduktion, tilbagevendende infektioner som følge af immunitetsundertrykkelse (f.eks. salmonellose), foruden embryotoksicitet hos dyr, der indtager lave foderkoncentrationer. Selv om de unge af en art er mest modtagelige, påvirkes alle aldre, men i forskellig grad for forskellige arter. Kliniske tegn på aflatoksicose hos dyr omfatter gastrointestinal dysfunktion, nedsat reproduktivitet, nedsat foderudnyttelse og effektivitet, anæmi og gulsot. Drægtige dyr kan blive påvirket som følge af omdannelsen af aflatoksin B1 til metabolitten aflatoksin M1, der udskilles i mælk fra malkekvæg.

Aflatoksiner har været genstand for omfattende undersøgelser af kræftfremkaldende virkninger. Det er blevet påvist, at aflatoksin B1, aflatoksin M1 og aflatoksin G1 forårsager forskellige former for kræft hos forskellige dyrearter. Det er imidlertid kun aflatoksin B1, der af Det Internationale Kræftforskningscenter (IARC) anses for at have frembragt tilstrækkelige beviser for kræftfremkaldende virkning i forsøgsdyr til at blive identificeret som kræftfremkaldende.

Aflatoksiner og menneskers sundhed

Mennesker udsættes for aflatoksiner ved at indtage fødevarer, der er forurenet med produkter fra svampevækst. En sådan eksponering er vanskelig at undgå, fordi svampevækst i fødevarer ikke er let at forhindre. Selv om stærkt forurenede fødevarer ikke er tilladt på markedet i de udviklede lande, er der stadig bekymring for de mulige skadelige virkninger som følge af langvarig eksponering for lave niveauer af aflatoksiner i fødevarerne.
Der er blevet rapporteret om akut aflatoksicose hos mennesker fra mange dele af verden, nemlig fra tredjeverdenslande som Taiwan, Ouganda, Indien og mange andre. Syndromet er karakteriseret ved opkastning, mavesmerter, lungeødem, kramper, koma og død med cerebralt ødem og fedtholdig involvering af lever, nyrer og hjerte.

Betingelser, der øger sandsynligheden for akut aflatoksicose hos mennesker, omfatter begrænset adgang til fødevarer, miljøforhold, der fremmer svampeudvikling i afgrøder og råvarer, og mangel på reguleringssystemer til overvågning og kontrol af aflatoksiner.

Da aflatoksiner, især aflatoksin B1, er stærkt kræftfremkaldende i visse dyr, er der interesse for virkningerne af langvarig eksponering for lave niveauer af disse vigtige mykotoksiner på mennesker . I 1988 satte IARC aflatoksin B1 på listen over kræftfremkaldende stoffer for mennesker. Dette understøttes af en række epidemiologiske undersøgelser foretaget i Asien og Afrika, som har vist en positiv sammenhæng mellem aflatoksiner i kosten og levercellekræft (LCC). Desuden kan udtrykket af aflatoksinrelaterede sygdomme hos mennesker påvirkes af faktorer som alder, køn, ernæringstilstand og/eller samtidig eksponering for andre sygdomsfremkaldende stoffer som f.eks. viral hepatitis (HBV) eller parasitangreb.

Nyere analysemetoder for aflatoksiner i fødevarer og foderstoffer

Stikprøveudtagning og prøveforberedelse :

Stikprøveudtagning og prøveforberedelse er fortsat en betydelig fejlkilde i forbindelse med den analytiske identifikation af aflatoksiner. Det er derfor absolut nødvendigt med en systematisk fremgangsmåde for prøveudtagning, prøveforberedelse og analyse for at bestemme aflatoksiner på parts-per-billion-niveau. I denne henseende er der blevet udviklet og nøje afprøvet specifikke planer for nogle varer som f.eks. majs, jordnødder og nødder; prøveudtagningsplaner for andre varer er blevet udformet efter disse planer. Et fælles træk ved alle prøveudtagningsplaner er, at hele den primære prøve skal formales og blandes, således at analysedelen har samme toksinkoncentration som den oprindelige prøve.

Festfaseekstraktion :

Alle analytiske procedurer omfatter tre trin: ekstraktion, rensning og bestemmelse. Den mest betydningsfulde nylige forbedring af rensningstrinnet er brugen af fastfaseekstraktion.
Proveekstrakter renses op før instrumentalanalyse (tyndlagskromatografi eller væskekromatografi) for at fjerne medekstraherede materialer, der ofte forstyrrer bestemmelsen af målanalyterne.

Tyndtlagskromatografi :

Tyndtlagskromatografi (TLC), også kendt som fladbedskromatografi eller planarkromatografi, er en af de mest udbredte separationsteknikker i aflatoksinanalyser. Siden 1990 har den været anset for at være den officielle AOAC-metode og den foretrukne metode til at identificere og kvantificere aflatoksiner i niveauer helt ned til 1 ng/g. TLC-metoden anvendes også til at verificere resultaterne ved hjælp af nyere, mere hurtige teknikker.

Væskekromatografi :

Væskekromatografi (LC) ligner TLC i mange henseender, herunder anvendelse af analysestoffer, stationær fase og mobil fase. Flydende kromatografi og TLC supplerer hinanden. Det er ikke usædvanligt, at en analytiker anvender TLC til indledende arbejde for at optimere LC-separationsbetingelserne.
Væskekromatografimetoder til bestemmelse af aflatoksiner i levnedsmidler omfatter normalfase-LC (NPLC), reversed-phase-LC (RPLC) med før- eller før-kolonne-derivatisering (BCD), RPLC efterfulgt af postkolonne-derivatisering (PCD) og RPLC med elektrokemisk detektion.

Immunokemiske metoder :

Tyndlagskromatografi og LC-metoder til bestemmelse af aflatoksininer i fødevarer er besværlige og tidskrævende. Ofte kræver disse teknikker viden om og erfaring med kromatografiske teknikker for at løse separations- og interferensproblemer. Takket være fremskridt inden for bioteknologien findes der nu i handelen højtspecifikke antistofbaserede test, som kan identificere og måle aflatoksiner i fødevarer på mindre end 10 minutter. Disse test er baseret på de monoklonale eller polyklonale antistoffers affinitet for aflatoksiner. De tre typer af immunokemiske metoder er radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) og immunoaffinitetssøjleassay (ICA).

Bekræftelse af aflatoksinernes identitet :

Selv om analysemetoderne kan bestå af forskellige ekstraktions-, rensnings- og kvantificeringstrin, bør resultaterne af analyserne ved hjælp af sådanne metoder være ens, når metoderne anvendes korrekt. Da der ikke er tvivl om pålideligheden af de kvantitative data, er det problem, der stadig mangler at blive løst, at bekræfte aflatoksinernes identitet. De anvendte bekræftelsesteknikker omfatter enten kemisk derivatisering eller massespektrometri (MS).

Sikkerhedsspørgsmål i forbindelse med håndtering af mugne kerner og aflatoksiner :

Sikkerhed er et centralt spørgsmål for forskere, der arbejder med aflatoksiner.Der skal tages skridt til at minimere eksponeringen for toksinerne og for de producerende mikroorganismer, Aspergillus flavus og Aspergillus parasiticus. Der bør etableres et sikkerhedsprogram, som opfylder kravene i Laboratory Standard of the Occupational Safety and Health Administration (1990) og retningslinjerne fra National Institutes of Health (1981) vedrørende brugen af kemiske kræftfremkaldende stoffer.

Overvågningsteknikker til vurdering af menneskers eksponering for aflatoksiner

I de sidste par år er der blevet udviklet nye teknologier, som mere nøjagtigt overvåger den individuelle eksponering for aflatoksiner. Der er lagt særlig vægt på analyse af aflatoksin-DNA-addukter og albuminaddukter som surrogater for genotoksicitet hos mennesker. Autrup et al. (1983) var banebrydende for brugen af synkron fluorescensspektroskopi til måling af DNA-addukter af aflatoksin i urinen. Urinprøver indsamlet efter eksponering for alfatoksiner viste sig at indeholde 2,3-dihydroxy-2-(N7-guanyl)-3-hydroxyaflatoxinB1, trivielt kendt som AFB-Gual . Wild et al. (1986) anvendte meget følsomme immunoassays til at kvantificere aflatoksiner i menneskelige kropsvæsker. Der blev anvendt et enzymrelateret immunosorbentassay (ELISA) til at kvantificere aflatoksin B1 i et interval fra 0,01 ng/ml til 10 ng/ml, og det blev valideret i urinprøver fra mennesker. Ved hjælp af denne metode blev det konstateret, at aflatoksin-DNA-adduktudskillelsen i urinen var positivt korreleret med indtagelsen gennem kosten, og det viste sig, at det største aflatoksin B1-DNA-addukt, der udskilles i urinen, er et velegnet mål for overvågning af aflatoksineksponering gennem kosten.

Kontrol og forvaltning af aflatoksiner

A- Lovgivningsmæssig kontrol:

Aflatoksiner anses for at være uundgåelige forurenende stoffer i fødevarer og foder, selv når der er fulgt god fremstillingspraksis. FDA har opstillet specifikke retningslinjer for acceptable niveauer for aflatoksiner i fødevarer og foderstoffer ved at fastsætte aktionsniveauer, som gør det muligt at fjerne partier, der overtræder reglerne, fra handelen. Indsatsniveauet for fødevarer er 20 ppb aflatoksiner i alt, med undtagelse af mælk, for hvilket indsatsniveauet for aflatoksin M1 er 0,5 ppb. For de fleste foderstoffer er aktionsniveauet også 20 ppb. Det er imidlertid meget vanskeligt at foretage et nøjagtigt skøn over aflatoksinkoncentrationen i en stor mængde materiale på grund af den variabilitet, der er forbundet med testprocedurerne; derfor kan den reelle aflatoksinkoncentration i et parti ikke bestemmes med 100 % sikkerhed.

B- Afgiftningsstrategier :

Da aflatoksinforurening er uundgåelig, er der foreslået mange strategier til afgiftning af aflatoksiner. Disse omfatter fysiske metoder til adskillelse, termisk inaktivering, bestråling, ekstraktion med opløsningsmidler, adsorption fra opløsning, mikrobiel inaktivering og fermentering. Kemiske metoder til afgiftning anvendes også som en vigtig strategi for effektiv afgiftning:

Strukturel nedbrydning efter kemisk behandling :
En forskelligartet gruppe af kemikalier er blevet testet for deres evne til at nedbryde og inaktivere aflatoksiner. En række af disse kemikalier kan reagere for at ødelægge (eller nedbryde) aflatoksiner effektivt, men de fleste er upraktisk eller potentielt usikre på grund af dannelsen af giftige restkoncentrationer eller forstyrrelsen af produktets indhold af næringsstoffer og organoleptiske egenskaber. To kemiske metoder til afgiftning af aflatoksiner, som har fået stor opmærksomhed, er ammoniakering og reaktion med natriumbisulfit.
Mange undersøgelser viser, at kemisk behandling ved hjælp af ammoniakering kan være en effektiv metode til at afgifte aflatoksinforurenet majs og andre varer. Mekanismen for denne virkning synes at indebære hydrolyse af lactonringen og kemisk omdannelse af moderforbindelsen aflatoxin B1 til talrige produkter, der udviser stærkt nedsat toksicitet.
På den anden side har natriumbisulfit vist sig at reagere med aflatoksiner (B1, G1 og M1) under forskellige temperatur-, koncentrations- og tidsbetingelser for at danne vandopløselige produkter.

Modifikation af toksicitet ved hjælp af kemiske stoffer i kosten :
Mykotoksiners toksicitet kan i høj grad påvirkes af kemiske stoffer i kosten, som ændrer pattedyrsystemernes normale reaktion på disse stoffer.En varierende række kemiske faktorer, herunder ernæringsmæssige komponenter (f.eks. protein og fedt i kosten, vitaminer og sporstoffer), tilsætningsstoffer til fødevarer og foderstoffer (f.eks. antibiotika og konserveringsmidler) samt andre kemiske faktorer kan interagere med virkningerne af aflatoksiner hos dyr.

Forhøjelse af biotilgængeligheden ved hjælp af kemisorbenter til aflatoksiner :
En ny metode til afgiftning af aflatoksiner er tilsætning af uorganiske sorbentmaterialer, såkaldte kemisorbenter, som f.eks. hydratnatriumcalciumaluminosilikat (HSCAS) til foderet til dyr. HSCAS har evnen til at binde aflatoksiner tæt og immobilisere dem i dyrenes mave-tarmkanal, hvilket resulterer i en betydelig reduktion af aflatoksinets biotilgængelighed.

Økonomiske konsekvenser af aflatoksiner

De økonomiske konsekvenser af aflatoksiner er indirekte afledt af tab af afgrøder og husdyr samt indirekte af omkostningerne ved reguleringsprogrammer, der har til formål at reducere risici for dyrs og menneskers sundhed. Fødevare- og Landbrugsorganisationen (FAO) anslår, at 25 % af verdens fødevareafgrøder er angrebet af mykotoksiner, hvoraf de mest kendte er aflatoksiner. Aflatoksintab for husdyr- og fjerkræproducenter som følge af aflatoksinforurenet foder omfatter døden og de mere subtile virkninger af undertrykkelse af immunsystemet, nedsat væksthastighed og tab af fodereffektivitet. Andre negative økonomiske virkninger af aflatoksiner er bl.a. lavere udbytte af fødevare- og fiberafgrøder.

Dertil kommer, at aflatoksiners evne til at forårsage kræft og beslægtede sygdomme hos mennesker på grund af deres tilsyneladende uundgåelige forekomst i fødevarer og foder gør forebyggelse og afgiftning af disse mykotoksiner til et af de mest udfordrende toksikologiske spørgsmål i øjeblikket.

Anon. 1989. Mycotoxiner, økonomiske og sundhedsmæssige risici. Rådet for Landbrugsvidenskab og Teknologi, rapport nr. 116, s. 91.

Eaton, D.L. og Groopman, J.D. 1994. Aflatoxiners toksikologi. AcademicPress, New York, s. 383-426.

Finley, J.W., Robinson, S.F. og Armstrong, D.J. 1992. Food Safety Assessment.American Chemical Society, Washington, D.C. pp261-275.

Goldbatt, L.A. 1969. Aflatoxin. Academic Press,New York. pp1-40.

Heathcote, J.G. og Hibbert, J.R. 1978. Aflatoksiner: Kemisk og biologisk aspekt. Elsevier, New York. pp.173-186.

Liener, I.E. 1969. Toxinbestanddele i vegetabilske levnedsmidler. AcademicPress , New york. pp392-394.

Wyllie, T.D. og Morchause,L.G. 1978. Mycotoxin Fungi, Mycotoxins,Mycotoxicoses-An Encyclopedic Handbook.Vols.1,2, and 3.Marcel Dekker, Inc. Newyork.