Det overordnede mål med denne procedure er at udtrække RNA og DNA sekventielt fra arkiverede formalinfikserede paraffinindlejrede vævskerner. Dette er en protokol til udtagning af vævskerner, hvorfra vi vil udtrække både RNA og DNA. Den største fordel ved denne protokol er, at den forbedrer RNA- og DNA-udbyttet fra præcist målrettede områder i vævsblokken.

Denne procedure er i vid udstrækning udviklet i arkiverede prostatakræftvæv. Den kan også anvendes på andre typer arkiverede væv. Den visuelle demonstration af denne metode er kritisk, da vævsudtagningstrinene ikke er almindeligt anvendt i forskningslaboratorier.

De fleste forskningslaboratorier anvender i stedet tværsnit, hvilket udtømmer vævene hurtigere og tilføjer betydelig heterogenitet til prøven. Begynd med at gennemgå objektglasset i mikroskopet og skitsere det område, der er af interesse, ved hjælp af en permanent tusch med fin spids. Skær derefter et stykke paraffinfilm ud, der er stort nok til at dække det interessante område på objektglasset.

Sæt derefter filmen fast på objektglasset, og pak filmen ind over kanterne, så den ikke glider. Ved hjælp af en permanent tusch med fin spids skitseres hele vævet og det relevante område i vævet. Derefter fjernes filmen fra objektglasset og overføres til den tilsvarende vævsblok.

Orientér filmen ved at vende eller dreje den, således at omridset af hele vævet svarer til den observerede form af vævet i blokken. Tryk filmafsnittet fast mod blokens overflade for at forhindre, at det glider. Med spidsen af den permanente tuschmærke laves lavvandede, men synlige indrykninger langs omridset af det pågældende område, hvorefter filmen fjernes.

Rens derefter receptorstemplet fra 0,6 millimeter stempelsættet ved at nedsænke spidsen i et 1,5 milliliter mikrocentrifugeringsrør indeholdende 1 milliliter blegemiddel og skubbe stemplet op og ned flere gange. Gentag vaskningen med et rør indeholdende 70 % ethanol og derefter vand. Tryk nu det rensede stempel ind i det pågældende område i tre millimeters dybde, og træk det tilbage.

Løsgør kernen i et mikrocentrifugerør med lavt bindingsindhold ved at skubbe den ud af stemplet med stylus. Der tilsættes en milliliter xylen til de mikrofuge-rør, der indeholder vævskernerne, og der hvirvles kraftigt i 10 sekunder. Derefter anbringes de i en varmeblok indstillet til 50 grader Celsius i tre minutter.

Efter inkubationen centrifugeres de i to minutter ved stuetemperatur ved maksimal hastighed i to minutter. Efter centrifugeringen lægges kernerne på is i fem minutter for at størkne den voksagtige rest. Nu fjernes forsigtigt den paraffin, der har ophobet sig omkring menisken, sammen med supernatanten ved hjælp af en pipettespids.

Dernæst gentages xylenbehandlingen. Efter fjernelse af paraffin-xylen-blandingen tilsættes en milliliter 100 % ethanol, og der hvirvles kraftigt i 10 sekunder. Efter centrifugering ved maksimal hastighed i to minutter kasseres ethanolen omhyggeligt.

Gentag ethanolvaskningen en gang mere, inden homogeniseringen påbegyndes. Resuspensionér de deparaffiniserede kerner i 700 mikroliter 100 % ethanol inden homogenisering. Brug en motoriseret vævshomogenisator på en medium indstilling til at male kernerne til fine partikler.

Grundig homogenisering af vævskernerne er påkrævet for at opnå et optimalt DNA- og RNA-udbytte. Derefter fyldes separate 15-milliliter-rør med ca. ti milliliter blegemiddel, RNase-neutraliserende opløsning og 70 % ethanol. Efter homogenisering af prøven vaskes homogenisatorsonden i hver af rengøringsopløsningerne i rækkefølge.

Kør homogenisatoren på den højeste hastighed under vaskefasen. Tør sonden af med et viskestykke, og lad sonden tørre helt, inden du homogeniserer den næste prøve. Kontroller sondebladene visuelt for rester af vævsstykker, og hvis de findes, skal sonden rengøres igen.

Efter homogenisering bringes prøvevolumenet op på 1 milliliter med 100 % ethanol, hvorefter der centrifugeres ved maksimal hastighed i 15 minutter. Aspirer forsigtigt ethanolen og lufttørrer pellets i ca. 15 til 20 minutter, inden du påbegynder proteinase K-ekstraktionen. Resuspensionér pelleterne i 150 mikroliter proteinase K-forbrydningsbuffer, og vip rørene for at løsne pelleterne.

Proteinase K-forbrydning over natten anbefales for at opnå større DNA-genvinding. Der tilsættes 10 mikroliter temperaturstabil proteinase K, og der blandes ved at svirpe. Inkubér ved 56 grader Celsius i 15 minutter med let omrøring.

Inkubér rørene på is i tre minutter. Efter afkøling centrifugeres røret i 15 minutter ved maksimal hastighed. Derefter overføres hver supernatant forsigtigt uden at forstyrre pellets til et nyt mikrocentrifugeringsrør til RNA-oprensning uden at forstyrre pellets.

Udtræk RNA og DNA ved hjælp af den optimerede procedure i den skriftlige protokol, som omfatter en forlænget vævsfordøjelsestid for DNA-udtrækning. RNA og DNA kan udvindes fra ældre formalinfikserede paraffinindlejrede vævsprøver ved hjælp af denne metode. Nukleinsyrer blev medekstraheret fra prostatakræftprøver med en prøvealder på mellem tre og 14 år.

Det gennemsnitlige udbytte var 2 270 nanogram RNA og 820 nanogram DNA. Interessant nok var der ingen signifikant korrelation mellem vævsprøvens alder og nukleinsyreudvinding. Samlet set var RNA- og DNA-udbytterne korreleret på tværs af prøverne, selv om der i de fleste tilfælde blev genvundet mere end dobbelt så meget RNA i forhold til DNA.

For at demonstrere ydeevnen af genomisk DNA ekstraheret med denne protokol blev bisulfitkonverterede DNA-ekstrakter fra arkiverede prostatakræftprøver amplificeret ved methyleringsspecifik PCR. ALU-repetitive elementer blev anvendt som en methyleringskontrol og viste kun ringe variation mellem prøverne. GSTP1, et gen, der vides at være hypermethyleret i prostatakræft, viste ingen påviselig amplifikation ved methyleringsspecifik PCR, når der blev anvendt DNA ekstraheret fra godartede prøver.

DNA-prøver fra patienter med aggressiv prostatakræft udviste påviselige QPCR-cyklus-tærskelværdier, der var lavere end dem fra indolente prostatakræftceller, hvilket indikerer øget methylering af GSTP1 i aggressiv prostatakræft. Når først denne teknik er behersket, kan den udføres på tre til fire timer for RNA og efter nattens fordøjelse på fire timer for DNA, hvis den udføres korrekt. Denne teknik bør gøre det muligt for forskere i molekylær patologi at udforske diagnostiske DNA- og RNA-biomarkører i en række forskellige kræftformer.

Når du har set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man forbereder vævskerner til ekstraktion af DNA og RNA fra præcist kortlagte områder af interesse i arkiverede vævsblokke.