Dr. Bang var meget interesseret i hvirvelløse dyrs kredsløbssystem. Han mente, at studier af dyr, hvor man kunne observere cirkulationen, ville føre til en større forståelse af de fysiologiske processer hos hvirveldyr som f.eks. mennesker.
I begyndelsen af 1950’erne, mens han var på Marine Biological Laboratory i Wood’s Hole, Maine, studerede Bang hestesko krabbens kredsløbssystem og dens reaktion på bakteriel infektion.
Han injicerede bakterier fra fersk havvand i hestesko krabber af forskellig størrelse og undersøgte deres reaktion. Normalt ville blodet danne en lille blodprop for at forsegle det inficerede område og forhindre flere bakterier i at trænge ind.
Men en dag bemærkede Bang, at en af hans krabber døde af en ukendt infektion, der havde fået næsten hele blodmængden i krabben til at størkne til en halvfast masse.
Det var aldrig set før!
Så han isolerede og dyrkede bakterien fra det første dyr og injicerede den i andre hestesko krabber. De fik også den samme koagulation og døde.
Han undersøgte sagen nærmere og fandt ud af, at kun “gramnegative” bakterier gav denne reaktion.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Gramnegative bakterier forårsager infektioner som f.eks. lungebetændelse og meningitis. Da Bang varmekillede bakterierne før injektionen, fik han stadig den samme koagulationsreaktion. Det betød, at der ikke var brug for levende bakterier for at få hestesko krabbens blod til at størkne.
Han offentliggjorde sine resultater i 1956 og lagde sine første observationer til side i næsten 10 år.
Enter Jack Levin.
I 1963, mens Bang diskuterede data fra sit hestesko krabbeprojekt, foreslog en kollega, at et samarbejde med en hæmatolog kunne hjælpe med at opklare mysteriet om koagulationen. Kollegaen anbefalede en forsker fra hans laboratorium, Dr. Jack Levin.
Levin brugte kaniner til at studere Shwartzman-reaktionen – den reaktion på endotoxiner, der får en blodprop til at danne sig i et blodkar og også ændrer hvirveldyrs trombocytfunktion.
Endotoxin er en nøglekomponent i cellevæggen hos alle gramnegative bakterier; det kan være svært at påvise og er resistent over for medicin.
Bang overtalte Levin til at tilbringe en sommer på Marine Biological Laboratory i Woods Hole, hvor han studerede lighederne mellem Limulus amøbocytter og menneskelige blodplader.
Han viste hurtigt, at cellefrit plasma fra en hestesko krabbe ikke ville størkne, men da han studerede blodcellerne, havde han problemer med at forhindre blodet i at størkne.
Han havde også et andet problem. Prøver, der var fine, da han forlod laboratoriet om aftenen, var koagulerede, da han vendte tilbage om morgenen, og ingen af de antikoagulerende midler på markedet gjorde nogen forskel.
Sjælsomhed fører til et Aha! Moment
Levin var forvirret, og han var ved at blive ret desperat for at finde ud af dette!
Kunne det skyldes bakterier eller en komponent af bakterier?
For at teste denne mulighed forberedte han nye prøver i sterilt, endotoxinfrit glasværk. Utroligt nok koagulerede blodet ikke!
Der gik det op for ham, at han havde identificeret en blodkoagulationsmekanisme, der blev udløst af tilstedeværelsen af gramnegative bakteriers endotoxin.
Ettermere kunne han vise, at hele blodkoagulationsmekanismen i Limulus var indeholdt i amøbocytterne og var ekstremt følsom over for tilstedeværelsen af endotoxiner.
Limulus polyphemus amebocytter
“Jeg tror, at kun en forsker, der arbejdede med endotoksiner, nogensinde ville have overvejet muligheden for, at endotoksiner fik Limulus’ blod til at størkne,” siger Levin.
Dette førte til, at Levin skabte og patenterede den ekstremt følsomme Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-test, som kunne teste for bakterielle endotoksiner ved hjælp af hestemuslingeblod.
Den eneste anden test for endotoksiner på det tidspunkt blev kaldt kaninpyrogentesten. Dengang krævede den amerikanske Food and Drug Administration, at alle injicerbare lægemidler skulle bestå pyrogentesten, før de kunne godkendes til brug.
Dengang var kaninpyrogentesten imidlertid en dyr, ineffektiv og ofte unøjagtig proces.
Du injicerer prøven i en gruppe kaniner. Hvis kaninerne fik feber i disse kaniner, dumpede lægemidlet testen. Hvis de ikke fik feber inden for 4-6 timer, bestod det.
Farmaceutiske virksomheder måtte huse tusindvis af kaniner for at kunne udføre disse test.
LAL-testen kan give et resultat på kun 45 minutter og kan påvise tilstedeværelsen af endotoxiner på niveauer på mindre end en del pr. billion.
Levin indså, at han havde et meget følsomt og hurtigt assay! Dette var hård konkurrence for kanintesten.
LAL-testen kan give et resultat på kun 45 minutter og kan påvise tilstedeværelsen af endotoksiner på niveauer på mindre end en del pr. billion.
Selv om LAL-testen først blev beskrevet i 1965, tog det næsten 20 år, før testen formelt blev godkendt som endotoksintest for slutprodukter af FDA!
Hvorfor tog det så lang tid?
Lad os se det i øjnene, folk kan ikke lide at ændre ting, og virksomheder modsætter sig virkelig forandringer. At indføre den nye, mere følsomme test betød, at medicinalvirksomhederne skulle omrokere og oprette en helt ny produktionslinje.
Det er tid og penge!
Men fløden stiger til sidst til tops; denne test var fløden af de bedste og er det stadig!
Efterspørgslen efter LAL er nu så stor, at det er blevet en af de mest værdifulde væsker på jorden, med en rapporteret pris i april 2018 på mellem 35.000 og 60.000 dollars pr. gallon!
Skalering af LAL-testen
LAL-testen er blevet udnævnt til et af de “100 vigtigste bidrag til folkesundheden” af Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
Ifølge Jack Levin er det den standardscreeningstest for endotoxinforurening på verdensplan, med ca. 17,5 millioner testede prøver (svarende til ca. 70 millioner udførte test) hvert år. Den anvendes kommercielt til at teste alle intravenøse væsker, parenterale lægemidler og implantabelt medicinsk udstyr, inden de anvendes hos patienter.
Hvordan fremstilles LAL?
Horseshoe crabs indfanges, og der stikkes et rør ind i dem for at suge deres blod af (se billedet ovenfor). Derefter centrifugeres det opsamlede blod for at koncentrere amebocytterne. Tilsætning af vand til de pakkede amøbocytter får dem til at gå fra hinanden og frigive koagulationsproteinerne (lysatet), som reagerer med endotoksinerne.
Denne måde at fremstille LAL på bliver fremhævet som en ikke-dødelig metode til at få blod fra krabben. Men det er den ikke. For det er ikke alle krabberne, der overlever!
I henhold til Atlantic State Marine Fisheries Commission, i deres 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report, indfanges og afblødes 600.000 hestesko krabber for at opfylde den årlige LAL-efterspørgsel.
Omkring 420-540.000 (70-90 %) af disse 600.000 krabber overlever ca. 420-540.000 (70-90 %) proceduren. Kombiner det med indgreb i levestederne, global opvarmning og yderligere 500.000+, der hvert år høstes og dræbes til brug som madding til åle- og hvillingfiskeri, og du kan se, hvorfor bestanden af hestesko krabber styrtdykker.
Og ikke nok med det, krabberne høstes i maj og juni, når de kommer i massevis på land for at parre sig, lægge æg og forhåbentlig bevare deres overlevelse.
Det er ikke en bæredygtig situation!
Er der bedre måder at lave LAL på?
“Den amerikanske hestesko krabbe overlevede dinosaurerne og har overlevet fire tidligere masseudryddelser, men er nu truet af medicinalindustrien, fiskersamfund, tab af levesteder, klimaforandringer og senest af kvælende tidevand af rødalger ud for USA’s østkyst.” fra Jonathan Watts i The Guardian
Der er to primære tiltag, der bliver fremhævet som måder at afhjælpe denne uheldige situation på.
En tilgang, der forsøges af medicinalindustrien, er akvakultur af hestesko krabber.
I første omgang var forsøgene på at opdrætte hestesko krabber ikke særlig succesfulde. Det så ud til, at efter 3-4 måneders dyrkning faldt hæmolymphproteinkoncentrationerne til et niveau, der resulterede i dødelighed. Man mente, at disse dødsfald var forbundet med ernæringsmangel.
Dr. Anthony Dellinger er professor i afdelingen for neurovidenskab ved University of North Carolina i Greensboro og videnskabsmand hos Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger og KBI har arbejdet hårdt på at udvikle et nyt, forbedret akvakulturanlæg. Deres forudsætning er, at “kontrolleret indsamling af LAL fra overvågede og velplejede hestesko krabber i akvakultur kan øge LAL-leverancemængderne, sikre artens levedygtighed og muliggøre nye kliniske innovationer.”
Hvis det lykkes, vil en pålidelig, bæredygtig og økonomisk produktion af større mængder LAL være til gavn for både natur og industri.
Dellinger og kolleger beskrev i detaljer, hvordan deres akvakulturanlæg fungerer i en artikel, der blev offentliggjort i Frontiers of Marine Science i april sidste år.
Lad os se på højdepunkterne og resultaterne af denne undersøgelse.
Først optimerede de et indendørs recirkulerende akvakulturanlæg, der pålideligt vedligeholder hestesko krabberne. Deres mål var at lette gentagne LAL-høstninger, samtidig med at dyrenes velbefindende opretholdes.
Den næste milepæl var at opnå en metode til gentagne høstninger med lav indvirkning på miljøet. For at gøre dette implanterede de kirurgisk et kateter i hestesko krabben. Alle deres forsøg viste, at hestesko krabberne tolererede disse katetre ganske godt.
Her er et hurtigt resumé af deres resultater.
De høstede og vedligeholdt 24 krabber i et år med 100 % overlevelse. Hestesko krabberne blev kontrolleret for LAL-aktivitet, æg- og sædfrigivelse og andre tegn, der kunne indikere nedsat helbred. Der blev ikke observeret sådanne tegn.
Krabberne blev afblødt fra katetrene ca. tre gange om måneden, hvilket potentielt svarer til ca. 36 afblødninger pr. krabbe i løbet af den 12 måneders periode. Der blev ikke konstateret problemer med de implanterede katetre i denne periode.
Når de beregnede de påløbne omkostninger, uden for det oprindelige layout af akvakulturanlægget, kom vedligeholdelsen af krabberne op på omkring 0,76 dollars pr. pund, et meget overkommeligt beløb!
Det vigtigste spørgsmål, der skulle besvares, var:
Hvordan er LAL fra de internt vedligeholdte hestesko krabber sammenlignet med LAL fra friskhøstede krabber?
Som det fremgår af figur 6 fra deres artikel, var der ingen signifikant forskel i LAL endotoxin koaguleringsaktivitet mellem de akvakulturerede og de vilde krabber. Og der var heller ingen reel forskel i aktiviteten fra blødninger taget på dag 1, 16 og 23.
Disse resultater fik dem til at konkludere,
“…akvakultur kunne dække industriens behov i flere år med det, der svarer til 5-10% af et års årlige fangst, hvilket ville efterlade næsten 600.000 HSC’er i naturen hvert år herefter. Faktisk tyder disse resultater på, at ∼60.000 HSC’er fra akvakultur bæredygtigt kunne afblødes 12-24 gange årligt og overskride den nuværende biomedicinske LAL-behov.”
Den anden tilgang eliminerer behovet for krabber helt.
Jeak Ling Ding havde sammen med sin mand og forskningspartner Bow Ho i Singapore et mål – at eliminere behovet for hestesko krabber helt og holdent.
Hun studerede Carcinoscorpius rotundicauda, en asiatisk art, der var meget mindre end atlantiske hestesko krabber, og de kunne ikke blødes meget uden at dø.
Ding’s forskning i LAL førte til opdagelsen af, at et molekyle kaldet faktor C var ansvarlig for dens koagulerende virkning. Ding isolerede genet for faktor C og brugte en virus til at indsætte det i insekttarmceller. Dette gjorde insekterne til små fabrikker, der producerede faktor C.
De modificerede insekter fremstiller tilstrækkelige mængder af faktor C, som derefter kan sælges som rekombinant* faktor C (rFC) på markedet som en levedygtig erstatning for LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Så nu kunne de i stedet for at høste eller akvakulturere hestesko krabber og afbløde dem, kunne de dyrke store mængder insekter og isolere rFC.
Farmaceutiske virksomheder, der har brugt rFC, har bekræftet, at det virker lige så godt som LAL, og at produktionsomkostningerne er sammenlignelige.
“Vi var bare så ivrige som forskere, så glade for, at det virker,” sagde Ding. “Og vi troede, at den rekombinante faktor C ville blive indført i hele verden, og at hestesko krabben ville blive reddet.”
Derimod stod rFC desværre over for de samme hindringer for udbredelsen som LAL, da det blev introduceret. Selv om rFC har været på markedet siden 2003, har det været langsomt til at vinde indpas. Men lidt efter lidt er det ved at overvinde hindringerne for dets godkendelse af FDA. Oprindeligt var der kun én producent, der fremstillede det – den schweiziske kemikalievirksomhed Lonza Group.
I 2013 blev Hyglos GmbH den anden virksomhed, der fremstillede rFC. Kevin Williams, seniorforsker hos Hyglos, siger, at han mener, at indførelsen og godkendelsen af rFC for længst burde have været gennemført. Hyglos GmbH har fået godkendt brugen af den af flere europæiske tilsynsmyndigheder.
I dag mener eksperter, at rFC i sidste ende vil blive den dominerende metode til påvisning af endotoksiner og dermed lade hestesko krabberne slippe helt af med den industrielle produktion.
Det er noget, som hestesko krabber kan leve med!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Det bringer os til det sidste spørgsmål, jeg vil se på:
Hvorfor bekymrer vi os overhovedet om hestesko krabber overlever?
Er de ikke bare gamle levn, som vores moderne økosystem sagtens kunne undvære? Masser af andre arter er uddøde, og planeten virker ret ok.
Det er et gyldigt spørgsmål, så lad os se lidt dybere på det.
Det umiddelbare svar er: “Selvfølgelig vil vi redde dem!” Vi har nok skabninger på denne planet, der allerede er truet eller allerede er uddøde. Vi har bare ikke råd til at miste flere.
Som jeg sagde, er det mere en mavefornemmelse, ikke et svar, man kan hænge sin hat på. For at få et bedre svar er vi nødt til at se på, hvordan hestesko krabber passer ind i det store billede.
Lad os starte med, hvad de spiser, og hvad der spiser dem.
Den voksne hestesko krabbe lever af små bløddyr som blåmuslinger og strandmuslinger og orme.
I 2017 var blåmuslinger ikke i alvorlig fare ifølge denne rapport fra The Safina Center på Stony Brook University. Det samme gælder for både anneliderne og surfermuslingerne.
Ungdyrene lever af små partikler af både alge- og animalsk materiale. Efterhånden som dyret vokser i størrelse, gør det samme sig gældende for det bytte, det spiser.
I det hele taget ser det ud til, at hestesko krabber ikke har nogen skadelige virkninger på deres byttearter.
Okay, det er den ene side af sagen. Hvad med den anden? Hvad spiser hestesko krabber?
Horshøjkrabbens æg er en fødekilde for mange organismer.
Disse omfatter kystfugle, nogle fisk – stribet aborre, stribet killifisk, silversider, skrubber – samt havskildpadder, krabber og hvillinger. De er en vigtig fødekilde for 11 arter af trækkende kystfugle. Tab af disse æg ville ødelægge disse fuglebestande.
Loggerhead havskildpadder og kystfugle som f.eks. den røde knude er afhængige af hestesko krabber.
Tusindvis af disse skildpadder vandrer til Chesapeake- og Delaware-bugten om sommeren for at spise krabberne. Det menes nu, at loggerheads lider under manglen på hestesko krabber i Chesapeake.
Et par anekdoter beretter om, at hestesko krabber dukker op i maver fra alligatorer og hajer.
Hestesko krabbeunger kan også være en vigtig føde i det kystnære fødevæv. I løbet af sommeren og efteråret vrimler det med larve- og tidlige livsstadier af hestesko krabber i de lavvandede områder. Disse bidder bliver uden tvivl også slugt af fisk og kystfugle.
Og det ser ud til, at der er masser af andre dyr, som finder dem ganske velsmagende, og som ville have svært ved at finde nemme erstatninger.
For et dyr, der har eksisteret i 450 millioner år, er vores forståelse langt fra komplet om den rolle, som Limulus polyphemus spiller i det kystnære økosystem.
Med den nuværende tilstand af vores viden om hestesko krabbens økologi kan vi ikke endegyldigt konkludere, hvor afgørende deres rolle er. Det vi kan sige er, at de helt sikkert indtager en niche, som fortjener at blive undersøgt mere seriøst.
Så kommer jeg alligevel ned på siden for behovet for at bevare dem! Det er min “hellere være sikker end ked af det”-holdning. Vi ved bare for lidt til at lade en art som Limulus polyphemus glide os mellem fingrene og forsvinde, hvis vi kan forhindre det.
Så, er der noget, du kan gøre?
Hvis du tilfældigvis bor i nærheden af et sted, hvor hestesko krabber kommer for at lægge æg, er det let at kaste op og hjælpe. Der findes programmer til at vende krabber og undersøgelser af gydende krabber, som er afhængige af frivillige.
Og endelig skal du huske hestesko krabben, når du går til lægen. Alt, der injiceres eller implanteres i vores kroppe, bliver stadig testet for gramnegativ bakterieforurening med LAL fremstillet af hestesko krabbeblod.
Til næste gang
Rich
Hey! Hvis du nød denne artikel, så tilmeld dig mit nyhedsbrev og få en gratis e-bog!
Kilder til oplysninger, der er brugt til denne artikel:
- The Horseshoe Crab
- Horseshoe Crab Aquaculture as a Sustainable Endotoxin Testing Source
- The Role of Horseshoe Crabs in the Biomedical Industry and Recent Trends Impacting Species Sustainability
- The Last Days of the Blue-Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- Denne krabbe kan redde dit liv – hvis mennesket ikke udrydder den først
- NJ stoppede sin hestehøjkrabbehøst. Bør andre stater gøre det samme?
- Hjemmesiden om hestesko krabben er oprettet af Kayla Westerlund
- Hestesko krabben