ImmunohistokemiRediger

Immunohistokemi eller IHC-farvning af vævsafsnit (eller immunocytokemi, som er farvning af celler), er måske den mest almindeligt anvendte immunfarvningsteknik. Mens der i de første tilfælde af IHC-farvning blev anvendt fluorescerende farvestoffer (se immunofluorescens), anvendes der nu andre ikke-fluorescerende metoder, der anvender enzymer som peroxidase (se immunoperoxidasefarvning) og alkalisk fosfatase. Disse enzymer er i stand til at katalysere reaktioner, der giver et farvet produkt, som let kan påvises ved lysmikroskopi. Alternativt kan der anvendes radioaktive elementer som mærker, og immunreaktionen kan visualiseres ved autoradiografi.

Vævsforberedelse eller fiksering er afgørende for bevarelse af cellemorfologi og vævsarkitektur. Uhensigtsmæssig eller langvarig fiksering kan reducere antistofbindingsevnen betydeligt. Mange antigener kan påvises i formalinfikserede paraffinindlejrede vævsafsnit. Nogle antigener overlever imidlertid ikke selv moderate mængder aldehydfiksering. Under disse omstændigheder bør vævene hurtigt nedfryses i flydende nitrogen og skæres med en kryostat. Ulemperne ved frosne sektioner er bl.a. dårlig morfologi, dårlig opløsning ved højere forstørrelser, vanskeligheder ved at skære over paraffinsnit og behovet for frossen opbevaring. Alternativt kræver vibratomsnit ikke, at vævet behandles med organiske opløsningsmidler eller høj varme, som kan ødelægge antigeniciteten, eller at det forstyrres ved frysning og optøning. Ulempen ved vibratomsektioner er, at sektioneringsprocessen er langsom og vanskelig med blødt og dårligt fikseret væv, og at chattermærker eller vibratomlinjer ofte er tydelige i sektionerne.

Detektionen af mange antigener kan forbedres dramatisk ved hjælp af antigenudtagningsmetoder, der virker ved at bryde nogle af de proteinkrydsforbindelser, der er dannet ved fiksering, for at afdække skjulte antigener. Dette kan opnås ved opvarmning i forskellige tidsrum (heat induced epitope retrieval eller HIER) eller ved hjælp af enzymfordøjelse (proteolytisk induceret epitope retrieval eller PIER).

En af de største vanskeligheder ved IHC-farvning er at overvinde specifik eller uspecifik baggrund. Optimering af fiksationsmetoder og -tider, forbehandling med blokeringsmidler, inkubation af antistoffer med højt salt og optimering af vaskebuffere og vasketider efter vask af antistoffer er alle vigtige for at opnå immunfarvning af høj kvalitet. Desuden er tilstedeværelsen af positive og negative kontroller for farvning afgørende for at bestemme specificiteten.

FlowcytometriRediger

Et flowcytometer kan anvendes til direkte analyse af celler, der udtrykker et eller flere specifikke proteiner. Cellerne immunfarves i opløsning ved hjælp af metoder svarende til dem, der anvendes til immunofluorescens, og analyseres derefter ved flowcytometri.

Flowcytometri har flere fordele i forhold til IHC, herunder: evnen til at definere særskilte cellepopulationer ud fra deres størrelse og granularitet; evnen til at gate døde celler ud; forbedret følsomhed; og flerfarveanalyse til måling af flere antigener samtidig. Flowcytometri kan dog være mindre effektiv til at påvise ekstremt sjældne cellepopulationer, og der er et tab af arkitektoniske relationer i mangel af et vævssnit. Flowcytometri har også en høj kapitalomkostning forbundet med køb af et flowcytometer.

Western blottingRediger

Western Blotting gør det muligt at påvise specifikke proteiner fra ekstrakter fremstillet af celler eller væv, før eller efter eventuelle oprensningstrin. Proteinerne adskilles generelt efter størrelse ved hjælp af gelelektroforese, inden de overføres til en syntetisk membran ved hjælp af tørre, halvtørre eller våde blottingmetoder. Membranen kan derefter undersøges med antistoffer ved hjælp af metoder, der svarer til immunohistokemi, men uden behov for fiksering. Detektion udføres typisk ved hjælp af peroxidase-koblede antistoffer til at katalysere en kemiluminescensreaktion.

Western blotting er en rutinemæssig molekylærbiologisk metode, der kan anvendes til semikvantitativ sammenligning af proteinniveauer mellem ekstrakter. Størrelsesseparationen forud for blotting gør det muligt at måle proteinets molekylvægt i forhold til kendte molekylvægtmarkører.

Enzyme-linked immunosorbent assayRediger

Enzyme-linked immunosorbent assay eller ELISA er en diagnostisk metode til kvantitativ eller semikvantitativ bestemmelse af proteinkoncentrationer fra blodplasma, serum eller celle-/vævsekstrakter i et pladeformat med flere brønde (normalt 96 brønde pr. plade). Generelt set adsorberes proteiner i opløsning på ELISA-plader. Antistoffer, der er specifikke for det pågældende protein, anvendes til at undersøge pladen. Baggrunden minimeres ved at optimere blokering og vaskemetoder (som ved IHC), og specificiteten sikres ved tilstedeværelsen af positive og negative kontroller. Detektionsmetoderne er normalt kolorimetriske eller kemiluminescensbaserede.

Immuno-elektronmikroskopiRediger

Elektronmikroskopi eller EM kan bruges til at studere den detaljerede mikroarkitektur af væv eller celler. Immun-EM gør det muligt at påvise specifikke proteiner i ultratynde vævssnit. Antistoffer, der er mærket med tungmetalpartikler (f.eks. guld), kan visualiseres direkte ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi. Selv om immuno-EM er effektivt til påvisning af et proteins subcellulære lokalisering, kan det være teknisk udfordrende og dyrt og kræve en nøje optimering af vævsfikserings- og behandlingsmetoderne. Proteinbiotinylering in vivo blev foreslået for at afhjælpe de problemer, der skyldes hyppig inkompatibilitet mellem antistoffarvning og fikseringsprotokoller, der bedre bevarer cellemorfologien.