Klinisk betydning

Mikrosatellitinstabilitet (MSI) skyldes systematisk ophobning af deletioner/indsættelser i korte gentagne DNA-sekvenser i tumorceller med et mangelfuldt mismatch-reparationssystem (MMR). MSI forekommer i ca. 15 % af alle kolorektalcancer og er klinisk nyttig til at identificere patienter med arvelig ikke-polyposis kolorektal cancer (HNPCC, Lynch-syndromet) forårsaget af germline-mutationer i MMR-gener. MSI-status kan også forudsige kræftrespons/resistens over for visse kemoterapier.

I et forsøg på at standardisere MSI-analysen anbefalede en workshop i 1997 fra National Cancer Institute (NCI) et referencepanel af fem mikrosatellitmarkører til påvisning af MSI og opstillede retningslinjer for MSI-klassificering på grundlag af resultaterne. Referencepanelet, der kaldes Bethesda-panelet, består af to mononukleotidloci (Big Adenine Tract eller BAT-25 og BAT-26) og tre dinukleotidloci (D2S123, D5S346 og D17S250). Ved hjælp af Bethesda-panelet blev kræftformer med ustabilitet på 2 eller flere af disse loci fortolket som MSI-high (MSI-H), og kræftformer uden ustabilitet på nogen af de fem loci blev betragtet som Microsatellite Stable (MSS). På en yderligere opfølgende NCI-workshop blev det erkendt, at det oprindelige Bethesda-panels følsomhed og specificitet kunne være begrænset på grund af medtagelsen af dinukleotidrepetitioner, som er mindre følsomme og specifikke end mononukleotidrepetitioner med hensyn til identifikation af kræftformer med MMR-mangler. Det er blevet foreslået, at et panel af kvasimonomorfe mononukleotidrepeats kan være følsomt og specifikt nok til påvisning af MSI-høje kræftformer og kan overflødiggøre behovet for normalt matchende DNA for de tumorer, der testes (1-8).

MSI Analysis System (Research Use Only kit, Version 1.2, Promega Corporation).

MSI Analysis System er et multiplex, fluorescerende PCR-baseret assay til påvisning af mikrosatellitinstabilitet. MSI-analysesystemet omfatter fluorescerende mærkede primere til co-amplifikation af fem kvasimonomorfe mononukleotid-repeatmarkører (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og MONO-27). PCR-produkterne adskilles ved kapillarelektroforese (CE) ved hjælp af en Applied Biosystems 3500Dx Genetic Analyzer. Mikrosatellitinstabilitet på 2 eller flere mononukleotidloci fortolkes som MSI-høj; mikrosatellitinstabilitet på et enkelt mononukleotidlokus eller ingen ustabilitet på nogen af de testede loci fortolkes som mikrosatellitstabil (MSS). Typisk viser MSI-high-prøver ustabilitet på alle loci med et gennemsnitligt fald i produktstørrelsen på 5-9 baser. Tilstedeværelsen af MSI påvises med en analytisk specificitet på mindst 99 % og en detektionsgrænse på mindst 5 %.

Et vigtigt designtræk ved MSI-analysesystemet er afstanden mellem de fem forskellige loci, som generelt overstiger det typiske antal baser, der er forskudt (gennemsnitligt 5 til 9 baser), når MSI er til stede. Den længste PCR-ampliconstørrelse er 154 basepar, hvilket er fordelagtigt til analyse af formalinfikseret, paraffinindlejret væv (FFPE).

Dette assay er standarden for rutinemæssig MSI-testning med høj gennemløbskapacitet, især når der anmodes om andre molekylære downstream-analyser på den samme DNA-prøve.

Prøvekrav

Acceptable prøver til assayet er formalinfikserede, paraffinindlejrede kolorektalcarcinomvævsprøver med en fiksationstid på 6-48 timer.

Volume

1 repræsentativ paraffinblok foretrækkes. Alternativt kræves der for resektionsprøver mindst 5 ufarvede vævssnit (5 µm tykke).

Instruktioner for opbevaring og forsendelse

Prøver skal opbevares og sendes ved omgivelsestemperatur.

Begrænsninger

Udstrækkeligt tumorindhold giver muligvis ikke mulighed for påvisning af MSI-instabilitet: 10 % af tumorcellerne er påkrævet. Tumorindholdet vurderes forud for analysen, og der foretages makrodissektion. Andre fiksationsmidler end formalin eller forlænget fiksationstid kan give anledning til utilstrækkelige resultater.

Særlige krav

Ingen.

Turn-around-time

Fem til 7 arbejdsdage for henholdsvis objektglas og paraffinblokke.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Akkreditering afventer

IdyllaTM MSI Assay (RUO) udfører påvisning af mikrosatellitinstabilitet direkte fra formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) menneskelige kræftvævsafsnit ved hjælp af en PCR-reaktion efterfulgt af smeltekurveanalyse med høj opløsning på et IdyllaTM -instrument.

Assayet udfører påvisning af mutationer i 7 monomorfe homopolymer loci til identifikation af humane kræftformer med mikrosatellitinstabilitet (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A og SULF2). Disse biomarkører er tumorspecifikke, viser en høj frekvens i kolorektal- og endometriecancer og er stabile på tværs af forskellige etniciteter. Desuden kræver disse tumorspecifikke biomarkører ikke analyse af parrede normale vævsprøver.

MSI-status for en prøve bestemmes med den endelige udkaldelse for alle 7 biomarkører. Mikrosatellitinstabilitet på 2 eller flere mononukleotidloci fortolkes som MSI-høj; mikrosatellitinstabilitet på et enkelt mononukleotidlokus eller ingen instabilitet på nogen af de testede loci fortolkes som mikrosatellitstabil (MSS).

Dette assay giver mulighed for MSI-testning med lavt gennemløb og er ideel til reflekstest eller redningstest for hurtigt at opnå eller bekræfte et nøjagtigt MSI-resultat.

Prøvekrav

Acceptable prøver til assayet er formalinfikserede, paraffinindlejrede kolorektalcarcinomvævsprøver med en fiksationstid på 6-48 timer.

Volume

1 repræsentativ paraffinblok foretrækkes. Alternativt kræves der for resektionsprøver mindst 2 ufarvede vævssnit (5 µm tykkelse; 50-600 mm²).

Instruktioner for opbevaring og forsendelse

Prøver skal opbevares og sendes ved omgivelsestemperatur.

Begrænsninger

Udstrækkeligt tumorindhold giver muligvis ikke mulighed for påvisning af MSI-instabilitet: 20 % af tumorcellerne er påkrævet. Tumorindholdet vurderes forud for analysen, og der foretages makrodissektion. Andre fiksationsmidler end formalin eller forlænget fiksationstid kan give anledning til utilstrækkelige resultater.

Særlige krav

Ingen.

Turn-around-time

Tre til 5 arbejdsdage for henholdsvis objektglas og paraffinblokke.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability (Reviderede Bethesda-retningslinjer for hereditær ikke-polyposis colorectal cancer (Lynch syndrom) og mikrosatellitinstabilitet). Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer (Klinisk relevans af mikrosatellitinstabilitet i kolorektal cancer). Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Udvikling af et fluorescerende multiplex-assay til påvisning af MSI-høje tumorer. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers (Sammenligning af Microsatellite Instability Analysis System og Bethesda Panel til bestemmelse af mikrosatellitinstabilitet i kolorektalcancer). Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma (Multisite analytiske præstationsundersøgelser af et realtids-polymerasekædereaktionsassay til påvisning af BRAF V600E-mutationer i formalinfikserede paraffinindlejrede vævsprøver af malignt melanom). Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Quasimonomorfe mononukleotidgenvindinger til analyse af mikrosatellitinstabilitet på højt niveau. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. Et panel med fem markører i en multiplex PCR påviser nøjagtigt mikrosatellitinstabilitetshøje kolorektaltumorer uden kontrol-DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detektion af mikrosatellitinstabilitet ved hjælp af fluorescensmulitplex polymerasekædereaktion. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Påvisning af mikrosatellitinstabilitet (MSI) i prøver af kolorektal cancer med et nyt sæt meget følsomme markører ved hjælp af prototypen af IdyllaTM MSI-testen. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Opdateret den 23. maj 2019