Diskussion

Den menneskelige mikrobiota består af mere end tusind forskellige bakteriearter og spiller en vigtig rolle for menneskers sundhed ved at fremme næringsstofforsyningen, forhindre kolonisering af patogener og forme og opretholde normal immunitet i slimhinderne. Man har for nylig erkendt, at tarmbakterier har et ægte symbiotisk forhold til værten; inden for denne store pulje af bakterier er det blevet hævdet, at probiotiske kosttilskud indeholdende LAB (dvs. lactobaciller og bifidobakterier) har en række gavnlige virkninger på menneskers sundhed, f.eks. forebyggelse af diarré og inflammatoriske tarmsygdomme eller profylakse af urogenitale infektioner . Vores viden om de biokemiske roller, som specifikke arter og stammer spiller i menneskers sundhed og sygdom, er imidlertid meget begrænset. I denne undersøgelse har vi forsøgt at øge forståelsen af nitratreduktionsvejene i udvalgte almindelige bakteriearter, der koloniserer den menneskelige tarm, ved hjælp af in vitro-betingelser, der er forenelige med nitratrige diæter og iltniveauer, der findes på slimhindeoverfladerne i GI-kanalen. De primære resultater af vores undersøgelse viser, at: 1) E.coli, en fakultativ anaerobe bakterie, omdanner nitrat til nitrit og efterfølgende til ammoniak, som gradvist akkumuleres i kulturmediet; 2) L.plantarum, en fermentativ bakterie, dyrket i tilstedeværelse af eksogent hæm og vitamin K2 udfører lignende processer; 3) E.coli-enzymer genererer kun signifikant NO fra nitrit under anaerobe forhold; 4) alle undersøgte LAB-kulturer genererer store mængder mælkesyre, der forårsager tilstrækkelig forsuring af kulturmediet til at drive nitritdisproportionering til NO.

De fleste eukaryoter får deres energi primært gennem oxidativ fosforylering og skal indånde O2 til dannelse af ATP, men mange tarmbakterier, herunder E.coli K12-stammer, kan bruge NO3- som en alternativ elektronacceptor, når O2 er begrænsende, og nitrat er rigeligt . E.coli er et modelmedlem af Enterobacteriaceae, og selv om denne familie kun udgør en lille del af tarmmikrobiotaen, er den særlig vigtig, fordi visse stammer kan forårsage sygdomme. Det er også for nylig blevet påvist, at nitrat, der dannes som et biprodukt af værtsinflammation, kan anvendes af E.coli under respirationen til at give en vækstfordel og udkonkurrere mikrober i tyktarmen, der kun er afhængige af fermentering . L. plantarum betragtes som et sikkert probiotikum og findes almindeligvis i pattedyrs tarmkanalen og i menneskets spyt, hvor nitrat vides at akkumuleres til millimolære niveauer på grund af den entero-salivariske nitratcyklus, som tegner sig for ca. 25 % af det samlede cirkulerende nitrat . Denne bakterie har den typiske fakultative heterofermentative vej i LAB-familien, men for nylig blev der i L. plantarum WCFS1-genomet identificeret gener, der koder for et formodet nitrat-reduktasesystem (narGHJI), hvilket tyder på, at den er i stand til at bruge nitrat som elektronacceptor, hvilket er unikt for denne art. En nyligt offentliggjort genetisk analyse af L. plantarum har fremhævet dens enorme mangfoldige og alsidige metaboliske kapacitet.

I vores eksperimenter blev der påvist en betydelig nitratreduktaseaktivitet både i E.coli og L. plantarum, når iltspændingen falder fra atmosfærisk niveau mod nul. Derimod viste B.longum infantis, en mikro-ero-tolerant anaerobe fra spædbørns mave-tarmkanalen, ingen evne til at reducere nitrat, selv ved høje koncentrationer. Bifidobakterier udgør op til 90 % af bakterierne i et spædbarns GI-kanal, og vores resultater er i overensstemmelse med observationen af, at modermælk, som har et særligt højt nitritindhold, udgør en fødekilde for nitrit, før der etableres en lingual og tarm-mikrobiota, der er i stand til at reducere nitrat, og som normalt findes i den voksne flora.

I fig. 1 viste vi, at E.coli-kulturer, der indeholdt 5 mM NO3-, havde en konkurrencemæssig vækstfordel i forhold til kulturer uden tilsætning af nitrat, og derefter bestemte vi virkningen af ilt- og nitratgradienter på produktionen af nitrit og ammoniak. Vores resultater viser, at ca. 2,5 mM NO3- ved enten 4% eller lavere O2 er tilstrækkeligt til at inducere ekspression af nitratreduktaseenzymer, og at der efter 24 timer akkumuleres en betydelig mængde nitrit både inde i E.coli-cellerne og i kulturmediet. En detaljeret molekylær analyse af reguleringen af de bakterielle enzymatiske aktiviteter overskrider rammerne for denne undersøgelse, men det er velkendt, at E.coli K12-stammer udtrykker tre molybdænholdige nitratreduktaser, og at wolfram kan deaktivere disse enzymer ved at erstatte molybdænatomet på det aktive sted. Vi fandt, at tilsætning af 300 μM wolframoxid til kulturer dyrket som i eksperimenterne rapporteret i fig. 1 næsten helt afskaffede dannelsen af nitrit (data ikke vist). Vi mener således, at molybdænafhængige nitratreduktaser er ansvarlige for det afgørende trin i dannelsen af nitrit. Det er også vigtigt at bemærke, at E.coli såvel som mange andre bakteriearter er modtagelige for nitrittoksicitet på grund af dannelsen af metal-nitrosylkomplekser, og de minimerer denne toksicitet ved koordineret induktion af en nitritmembrantransportør og andre enzymer, der medierer nitritreduktion. En fuldstændig beskrivelse af E.coli nitrat- og nitritreduktaseenzymernes gener og operons regulering og ekspression kan findes i fremragende publikationer af Stewart og Cole.

Stikstofoxidreduktionsveje i den menneskelige tarm

Fordelingen af nitrat og nitrit i den nedre del af tarmkanalen afhænger af mange aspekter, herunder de bakterietyper, der koloniserer tarmen, og den indviklede balance mellem kosten og de metaboliske veje for nitrogenoxider. Imidlertid har den endogene produktion af nitrat fra NO-oxidation (hovedsagelig via reaktion med oxy-hemoglobin) længe været anerkendt for at være en størrelsesorden større end indtagelsen via kosten som vist i slutningen af 1970’erne og for nylig i undersøgelser med eNOS-deficiente mus . I den skematiske fremstilling i fig. 5 har vi opsummeret forbindelsen mellem bakteriel respiratorisk denitrifikation, reduktion af nitrogenoxider til ammoniak, den endogene L-arginin/NO-syntasevej og den ikke-enzymatiske nitritreduktion til NO. I denitrifikationsprocessen (rød boks) reduceres nitrat til kvælstofgas (N2) i en proces i fire trin, hvor nitrit, NO og lattergas er elektronacceptorer i energigenererende reaktioner. Det er for nylig blevet påvist, at der findes en komplet denitrifikationsvej, der fører til produktion af N2, i menneskelig tandplak, og selv om den stadig anses for at være af mindre betydning for mennesker, spekulerer vi i, at den kan spille en vigtig rolle under meget lav ilt iltspænding i tilstedeværelse af nitrat, og at dannelsen af N2 ikke kan udelukkes i menneskets tarm. Denitrifikation og dissimilatorisk nitratreduktion til ammoniak (DNRA, blå boks) deler det første trin af nitrat- til nitritreduktion, og flere klasser af nitratreduktaser er blevet associeret med denne reaktion. I DNRA er det andet trin den direkte reduktion af nitrit til ammoniak med seks elektroner, som ikke giver energi, men som er en ret almindelig afgiftningsproces i fakultative anaerobe bakterier. DNRA er blevet foreslået som den vigtigste metode til nitratmetabolisme i pattedyrs vommen. Denne undersøgelse identificerede ammoniak som et produkt af nitratreduktion i E.coli- og Lactobacilli-bakterier, der er dyrket i nærvær af mM nitrat ved 4% ilt eller lavere niveauer.

Udvide

Respiratorisk denitrifikation kan også generere små, men relevante mængder NO som et mellemprodukt og er blevet impliceret i den bakterielle NO-produktion i tarmen . Andre mulige veje, der giver NO, er den sure omdannelse af nitrit (grøn kasse) og oxidation af L-arginin af NOS-enzymer (brun cirkel). I fig. 4C undersøgte vi protonafhængigheden af den ikke-enzymatiske disproportionering af nitrit og viste, at den kun bliver relevant, når den intracellulære pH-værdi eller pH-værdien i kropsvæsken er lavere end 5,5. Vores resultater udelukkede også tilstedeværelsen af aktive NOS-enzymer i E.coli og L.plantarum, men tarmepitelceller er kendt for at producere NO gennem ekspression af både de endoteliale og inducerbare NOS-isoformer. Interessant nok kunne NO-produktionen i tarmen også udløses af de enzymatiske processer af peroxidaser, som er rigelige på cellerne i tarmslimhinden og har vist sig at bruge nitrit som substrat til at producere NO som en del af deres antibakterielle virkning.

Vi mener, at alle disse forskellige nitratreduktionsveje kan eksistere og forekomme samtidig, men det er sandsynligt, at kun én metabolit vil være fremherskende afhængigt af de specifikke fysiologiske forhold.

Fysiologisk betydning af NO-dannelse ved bakteriel nitratreduktion

Diætnitrat og nitrit fremstilles stadig som mulige giftige stoffer i mange undersøgelser på trods af de voksende beviser for, at NO-produktion fra disse ioner har vigtige gavnlige konsekvenser for kardiovaskulære, immunforsvaret og gastrointestinale funktioner . I tarmen tjener NO flere fysiologiske funktioner som f.eks. regulering af blodgennemstrømningen i slimhinden, tarmens mobilitet og slimtykkelse. Kronisk overproduktion af NO er også blevet forbundet med inflammatoriske tarmsygdomme og kan sandsynligvis hæmme væksten af en lang række bakteriearter. Tidligere undersøgelser lod det uklart, hvordan tarmbakterier producerede NO, men Sobko et al. viste imidlertid, at i modsætning til konventionelle rotter er NO-niveauet i tarmen hos bakteriefri rotter ekstremt lavt, og ved inokulering med normal bakterieflora steg den observerede NO-produktion 10 gange.

I vores eksperimenter bestemte ilt- og protonkoncentrationerne den specifikke rute for nitratreduktion til NO. Resultaterne præsenteret i fig. 4A viser, at E.coli er i stand til enzymatisk NO-aktivitet under anaerobe forhold med nitratkoncentrationer større end 1 mM muligvis via denitrifikation eller det periplasmatiske cytochrom c nitritreduktaseenzym (Nrf) som foreslået af Corker og Poole . Denne NO-generering er imidlertid stærkt reduceret ved 2 % ilt og bliver nitratuafhængig. Det er vigtigt, at vores data er i overensstemmelse med Sobko og kollegers rapport om, at E. coli genererede ubetydelige NO-niveauer under 24 timers inkubation med 0,1 mM nitrat . LAB producerede betydelige mængder NO som reaktion på forsuring af medierne som følge af ophobning af mælkesyre. Udskiftning af vækstmediet med friske LMRS (pH = 6,5) blokerede næsten fuldstændigt LAB-kulturernes evne til at omdanne nitrit til NO, men ikke hos E.coli. Målinger af tarmens pH-værdi varierer mellem 5,7 og 7,5, og derfor er nitritdisproportionering in vivo sandsynligvis et mindre og lokaliseret aspekt af NO-produktionen. Omvendt er denne vej et veletableret fænomen i mavens sure miljø (pH ca. 3).

Sammenfattende foreslår vi, at det NO, der genereres af tarmbakterier i nærheden af tarmslimhinden, enten kan udøve de gavnlige virkninger, der er nævnt ovenfor, eller ved højere niveauer, forstyrre disse funktioner. Således kan bakteriel NO-dannelse i tarmen betragtes som en modulator af både fysiologiske og patologiske virkninger.

Fysiologiske implikationer af bakteriel ammoniakdannelse for sundheden

Koloni-bakterier har været kendt for at producere ammoniak fra aminosyredeamination eller via urease, hydrolyse af urinstof til kuldioxid og ammoniak siden de skelsættende undersøgelser af Vince et al. i begyndelsen af 1970’erne . For nylig rapporterede Cole og kolleger, at det vigtigste produkt af nitritreduktion i E.coli er ammoniak, idet kun ca. 1% reduceres til NO ved neutral pH . Resultaterne fra vores undersøgelse tyder på, at i det mindste visse almindelige tarmbakterier primært reducerer nitrit til ammoniak snarere end NO. Hos raske personer under almindelige fysiologiske forhold udskilles størstedelen af den ammoniak, der dannes i det nedre GI-kanal, i kropsvæsken og metaboliseres af leverhepatocytterne, hvor ammoniak og kuldioxid enzymatisk omdannes til carbamoylphosphat, som indgår i den række af reaktioner, der kaldes “urinstofcyklusen”, og som fører til dannelse af urinstof og udskillelse af dette gennem nyrerne (se fig. 5). Den normale plasmakoncentration af ammoniak ligger i intervallet 10-35 μM, men når ammoniakproduktionen er for høj, kan ammoniak, der transporteres gennem portalblodet, gå uden om leveren, hvilket fører til hyperammonæmi . Ammoniak i blodet trænger frit gennem blod-hjernebarrieren, og høje koncentrationer (>100 μM) har toksiske virkninger på centralnervesystemet, hvilket fører til encephalopati og til sidst koma. Patienter med levercirrhose udvikler meget ofte hepatisk encephalopati (HE) . I mangel af leversvigt er hyperammonemisk koma blevet tilskrevet sepsis forårsaget af mikroorganismer med ureasekapacitet, f.eks. Klebsiella pneumonia . De klassiske terapeutiske metoder til behandling af HE omfatter reduktion af det systemiske ammoniakniveau via antibiotikabehandling (for at dræbe ammoniakproducerende bakterier i tarmene) og indgivelse af ikke-absorberbare sukkerstoffer som lactulose og lactitol . I tyktarmen nedbrydes laktulose af tarmbakterier primært til mælkesyre og også til små mængder myresyre og eddikesyre . Denne forsuring fremmer dannelsen af den ikke-absorberbare ammoniumion fra ammoniak og reducerer dens koncentration i plasma. Det er uklart, i hvilket omfang nitrat fra kosten bidrager til ammoniakkoncentrationen i tarmen og blodet, men vi foreslår den alternative hypotese, at den øgede forsuring af tarmindholdet som følge af tilstedeværelsen af lactulose fremmer mikrobiotaens omdannelse af nitrit til NO i stedet for ammoniak ved hjælp af den kendte syreafhængige mekanisme.

Konklusioner

I over 30 år har man ikke kunnet redegøre for den biologiske skæbne af eksogent nitrat i de udskilte nitrogenholdige forbindelser, som udgør ca. 60 % af en indtaget nitratdosis hos mennesker. Vores resultater understøtter idéen om, at nitrat omdannes til nitrit og derefter til andre reducerede kvælstofbiomolekyler såsom NO, ammoniak, urinstof og muligvis kvælstofgas af bakterier i spyt, mave, tynd- og tyktarm. Spørgsmål som f.eks. hvor meget ammoniak der dannes fra nitrat-nitritreduktionen i forhold til andre vigtige processer som deaminering og bakteriel ureaseaktivitet kræver detaljerede metaboliske undersøgelser på dyr og/eller mennesker. Den biologiske betydning af omdannelsen af nitrater fra kosten i tarmlumen er endnu ikke fastslået. Ikke desto mindre har traditionel japansk kost og middelhavskost, som er kendt for at have kardiovaskulære beskyttende virkninger, et gennemsnitligt indtag af nitrat pr. person, der er 2 til 3 gange højere end den typiske vestlige kost (i USA svarer det til ca. 40-100 mg/dag nitrat). Der er behov for yderligere undersøgelser af forbindelsen mellem symbiotiske bakterier, kvælstofoxidmetabolisme og menneskers sundhed; det er dog klart, at de biologiske veje for kvælstofmetabolisme hos pattedyr er mere komplekse og vigtigere, end man havde forestillet sig selv for få år siden.