Mathis begyndte at spille skuespil professionelt som 16-årig. Hendes første job var en reklamefilm for “Always Slender Pads – Just For Teens”. Hun spillede med i tv-serierne Aaron’s Way og Knightwatch fra 1988 til 1989. Hendes første hovedrolle i en spillefilm var som Nora i Pump Up the Volume (1990), over for Christian Slater, som hun kortvarigt datede på det tidspunkt. Mathis farvede sit naturlige blonde hår sort til rollen i et forsøg på at ændre sit image fra sødt og uskyldigt til viljestærkt.

Mathis medvirkede i tv-filmene Extreme Close-up, 83 Hours ’till Dawn og To My Daughter i 1990. Mathis og Slater havde stemmeroller i den animerede film FernGully: The Last Rainforest (1992). Hun optrådte derefter i komedien This Is My Life (1992), skrevet og instrueret af Nora Ephron, hvor hun spillede en usikker teenager. Mathis optrådte i teaterstykket Fortinbras i New York City i oktober 1992. Super Mario Bros. (1993), hvor hun spillede prinsesse Daisy fra det populære Nintendo-videospil, var en bombe i biografen, men fik en kultfølger siden udgivelsen.

Mathis mødte skuespilleren River Phoenix på settet af The Thing Called Love (1993), og de to indledte et forhold. Hun var sammen med Phoenix den 31. oktober 1993, den aften han døde på Cedars-Sinai Hospital af en overdosis stoffer efter at være faldet sammen uden for West Hollywoods Viper Room. Hun lavede filmen Jack and Sarah (1995), som blev optaget i London, for at komme ud af landet efter hans død på grund af den overdrevne pressedækning.

Mathis medvirkede i 1994 i filmatiseringen af Little Women og i How to Make an American Quilt (1995), begge med Winona Ryder i hovedrollen. Derefter optrådte hun i The American President (1995), hvor hun spillede assistenten til USA’s præsident. Mathis spillede sammen med Christian Slater igen, sammen med John Travolta, i John Woos Broken Arrow (1996). Hun tog lidt over et år fri fra skuespil, efter at hendes mor døde i 1996 af brystkræft.

Mathis medvirkede senere i American Psycho (2000), en filmatisering af Bret Easton Ellis’ roman af samme navn fra 1991. Hun spillede hovedrollen i Attraction (2000) og i The Simian Line (2001). Hun spillede hovedrollen i TNT’s tv-miniserie The Mists of Avalon (2001). Mathis spillede hovedrollen sammen med Thomas Jane i The Punisher (2004). Hun havde en gæsterolle i tv-serien Lost på ABC i rollen som Olivia Goodspeed. Hun spillede Jane Fonda’s datter i Broadway-showet “33 Variations”. Hendes indiefilm Lebanon, PA havde verdenspremiere på SXSW Film Festival i 2010. Hun medvirkede i en off-Broadway-produktion af stykket Love, Loss, and What I Wore på New York Citys Westside Theatre i oktober 2011.

I 2013 spillede Mathis psykiateren Alice Calvert i CBS tv-serien Under the Dome, baseret på en roman af Stephen King. I 2014 blev hun en del af castet i FX gyserdramaserie The Strain som Justine Feraldo, et byrådsmedlem for Staten Island i New York.

I 2019 optrådte Mathis Off-Broadway i rollen som Kate Conlee i Make Believe, et nyt stykke af Bess Wohl, der blev opført på Second Stage Theater. Michael Greif instruerede.

Hendes musical fra 2020, Whisper House, blev udskudt på grund af COVID-19 pandemien.