Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) og håndtering heraf

Kræft er en livstruende sygdom, der forårsager omkring 8 millioner dødsfald årligt på verdensplan. Spiserørskræft indtager sjettepladsen på listen over de mest almindelige årsager til kræftrelaterede dødsfald og bidrager med ca. en halv million dødsfald hvert år (GLOBOCAN 2012). Blandt de forskellige undertyper af spiserørskræft er ESCC den fremherskende histologiske type, og den er meget udbredt i mindre udviklede områder, især i visse regioner i Asien og Afrika. Der tilbydes multimodal behandling til ESCC-patienter. Patienter i et tidligt stadie med resektable tumorer behandles med en forudgående tumorresektion, mens avancerede patienter på den anden side først behandles med kemoterapi/kemoradiation med henblik på at nedtrappe tumoren før kirurgisk resektion . Selv om denne neoadjuverende behandling før kirurgi kan give et fremragende respons i undergrupper af patienter, som er følsomme over for kemoterapi/kemoradiation, har omkring en tredjedel af patienterne stadig kun et delvist og suboptimalt respons. Selv for dem, der reagerer på kemoterapi/kemoradiation, kan nogle af dem udvikle resistens i det senere forløb af behandlingsperioden. For de patienter, hvis tumorer er uoprettelige, og hvis tumoren er refraktær over for kemoterapi eller strålebehandling, er der ingen effektiv behandling til rådighed. For at give flere behandlingsmuligheder til patienter, der ikke kan ændres med de nuværende behandlinger, foreslås der nye behandlingsmetoder, som evalueres i igangværende kliniske forsøg for deres effektivitet mod tumorer. Selv med alle disse nye behandlingsmetoder, der er under udvikling, er det stadig vanskeligt at helbrede sygdommen fuldstændigt. I lyset heraf er der et presserende behov for nye behandlinger.

Anvendelse af tumor xenograft-dyremodeller til præklinisk forskning

Det vigtigste formål med at udvikle tumor xenograft-dyremodeller til forskning er at bygge bro mellem grundforskning og klinisk forskning og at supplere brugen af in vitro-modelsystemer . Tumor xenograft-dyremodeller giver en mere sofistikeret platform til undersøgelse af tumorigeneseprocessen i en in vivo-indstilling. Denne platform giver os mulighed for at få en bedre forståelse af visse onkogeners eller tumorsuppressors involvering i tumorudvikling ved at afdække deres relaterede signalveje og sygdomsmekanismer . Desuden kan brugen af disse modeller give os et forskningsværktøj til præklinisk evaluering af lægemiddelrespons ved at bestemme anti-tumorvirkningerne ud over lægemidletoksicitet, farmakokinetik og farmakodynamik . Ud over evaluering af lægemiddelrespons kan disse modeller også lette biomedicinsk billeddannelsesforskning ved at levere et modelsystem til afprøvning af nytten og anvendeligheden af nye tumordetektionsmetoder eller reagenser.

Mus er de mest almindeligt anvendte dyr til xenograftmodeller for tumorer på grund af flere vigtige fordelagtige egenskaber, såsom tilstedeværelsen af en genomstørrelse, der kan sammenlignes med menneskers, kort reproduktionscyklus, stor kuldstørrelse, lave vedligeholdelsesomkostninger og nem manipulation . Forskellige musestammer med unikke immundefektbaggrunde anvendes i kræftforskning, og disse omfatter athymiske nøgenmus, SCID-mus og NOD/SCID-mus (SCID-mus med et ekstra immundefektniveau). Blandt disse stammer udviser NOD/SCID-mus den bedste immundefekt på grund af fraværet af eller defekt i næsten alle typer immunceller (B-celler, T-celler, dendritiske celler, makrofager og naturlige dræberceller), efterfulgt af SCID-mus uden B-celler og T-celler og derefter athymiske nøgenmus uden T-celler . På grund af deres forskellige grader af immundefekt anses forskellige stammer for at kunne anvendes til forskellige forskningsformål. Under hensyntagen til de forskellige stammers omkostninger og egenskaber anvendes athymiske nøgenmus og SCID-mus fortrinsvis til implantering af humane tumorcellelinjer, mens SCID- og NOD/SCID-mus snarere anvendes til transplantation af humane tumorer.

Fælles anvendte tumor xenograft-dyremodeller til ESCC-forskning

Tre typer tumor xenograft-dyremodeller til ESCC-forskning er udviklet ved at implantere ESCC-celler/xenografts eller patienttumorer i immundefekte dyr, nemlig subkutan, ortotopisk og patientafledt tumor xenograft-model (fig. 1). Hver af dem har deres egne styrker og svagheder med hensyn til modelegenskaber (tabel 1), etableringsmetoder (tabel 2) og prækliniske anvendelser (tabel 3), som placerer dem i en unik position til forskning på tidlige, mellemste eller sene stadier .

Subkutan xenograft-tumormodel

Subkutan xenograft-tumormodel er en klassisk dyremodel til ESCC-forskning. Denne model etableres ved at implantere ESCC-celler/xenografts under huden på immundefekte dyr for at udvikle subkutane tumorer. Proceduren for etablering af subkutane tumorer er teknisk set enkel, da den kun omfatter nåleinjektion af ESCC-celler eller direkte implantation af ESCC-xenografts under huden på dyrene. Væksten af subkutane tumorer kan udføres ikke-invasivt ved hjælp af en elektronisk kaliper til måling af de håndgribelige tumorer. Disse tekniske procedurer for etablering og overvågning af tumorer kan opretholde denne models reproducerbarhed og effektivitet (både tidsmæssigt og økonomisk). På trods af disse fordele lider denne model under visse begrænsninger, da den ikke fuldt ud repræsenterer den kliniske situation. F.eks. er denne model forbundet med en reduceret tumorheterogenitet, da der i de fleste scenarier anvendes homogene ESCC-cellelinjer som kildemateriale. Desuden vokser subkutane tumorer ikke i deres oprindelige tumormikromiljø, hvilket gør dem uegnede til undersøgelse af interaktioner mellem tumor og strømhinde. Med sådanne styrker og svagheder anvendes denne model hovedsagelig i forskning på et tidligt stadie til at studere ESCC-tumorigenesens biologi og mekanisme.

Accumulerende rapporter har afsløret de store fordele ved at anvende subkutan tumor xenograft-model til forskning på et tidligt stadie ved at bruge den til at studere tumoregenskaber af ESCC-relaterede molekyler og deres tilknyttede sygdomsmekanismer. Overekspression af microRNA-340, et microRNA, der er nedreguleret i ESCC-tumorer, i EC9706 ESCC-celler hæmmer disse cellers vækstegenskaber i en subkutan tumor xenograft-model. Effekten af dette microRNA på ESCC blev formidlet delvist via dets virkning på en proteintransferase PSAT1, som i samme undersøgelse blev identificeret som et direkte mål for microRNA-340 . En anden undersøgelse påviste hurtigere vækst af subkutane tumorer afledt af KYSE-30 ESCC-celler med overekspression af matrixmetalloproteinasen MMP1 sammenlignet med kontrolcellerne. Desuden udviste disse MMP1-overeksprimerende ESCC-celler også metastatisk potentiale. MMP1’s evne til at fremme tumorprogression og metastase blev samstemmende afsløret som værende forårsaget af dets stimulerende virkning på en tumorigenisk vej, der involverer PI3K og AKT . En separat rapport anvendte også en subkutan tumor xenograft-model til at afsløre cellulært retinsyrebindende protein 2 (CRABP2) som en tumorundertrykker ved at vise langsommere væksthastighed af subkutane tumorer afledt af EC109 ESCC-celler, der overudtrykker CRABP2 sammenlignet med kontrolforsøgsgruppen . Disse undersøgelser viser tilsammen, at denne model er nyttig til undersøgelse af ESCC-relaterede molekyler og deres relaterede mekanismer i ESCC.

Afhængigt af brugen af subkutan tumor xenograft-model til tumorbiologiske undersøgelser er der gjort forsøg på at bruge denne model til at undersøge anti-tumorvirkningerne af nye behandlingsmetoder eller forbindelser/lægemidler til behandling af ESCC. Subkutane tumorbærende mus blev behandlet for at inducere ekspressionen af en ESCC-prognostisk markør microRNA-375, og der blev opnået en mindre tumorstørrelse ved forsøgets afslutning sammenlignet med kontrolforsøget . Ud over den rutinemæssige anvendelse til at undersøge nye behandlingsmetoder blev denne model også anvendt til at undersøge anti-tumorvirkningerne af nye forbindelser/lægemidler til bekæmpelse af ESCC, såsom temsirolimus, der i øjeblikket anvendes til patienter med nyrecellecarcinom . Ud over dens anvendelighed til testning af anti-tumorigenicitet kan denne model anvendes til at undersøge de kemo-sensibiliserende virkninger af testforbindelser. Behandling af subkutane tumorbærende dyr med ginsenosid Rg3, en ingrediens udvundet af ginseng, gav beviser for denne forbindelses sensibiliserende virkninger over for to kemoterapeutiske lægemidler paclitaxel og cisplatin, der almindeligvis anvendes til ESCC-patienter . For nylig blev det vist, at en ny iltbærer YQ23 udøver kemo-sensibiliserende virkninger selektivt på kemoresistente subkutane SLMT-1 ESCC xenografts, men ikke kemo-sensitive HKESC-2 ESCC xenografts, i behandlingsplaner med cisplatin eller 5-fluorouracil, som også er traditionelle kemoterapeutiske lægemidler, der anvendes til ESCC-patienter . Ovennævnte undersøgelser, der undersøger anti-tumoreffekten af testforbindelser/lægemidler alene eller i kombination med almindelige kemoterapeutiske lægemidler, der anvendes til ESCC, har fremhævet den prækliniske nytte af den subkutane tumor-xenograft-model til testning af forbindelser/lægemidler.

Sammenlagt er subkutane tumor xenograft-modeller, især de modeller, der er velkarakteriseret for deres følsomhed over for kemoterapeutika, der i øjeblikket anvendes til ESCC, værdifulde forskningsredskaber til undersøgelse af tumorbiologi og sygdomsmekanismer ved ESCC i in vivo-sammenhæng og til gennemførelse af prækliniske undersøgelser af anti-tumoreffektivitet (tabel 3).

Orthotopisk tumor xenograft-model

Orthotopisk tumor xenograft-model er en alternativ dyrekræftmodel, der anvendes til ESCC-forskning. Denne model etableres ved at implantere ESCC-celler/xenografts i spiserøret hos immundefekte dyr for at udvikle ortotopiske tumorer. Proceduren for etablering af ortotopiske tumorer er mere teknisk krævende sammenlignet med proceduren for etablering af subkutane tumorer, da den kræver kirurgi og/eller bedøvelse af smådyr. Der anvendes to hovedmetoder til at implantere ESCC-celler/xenografts i dyrenes spiserør, og de adskiller sig fra hinanden med hensyn til stedet for tumorimplantation. Ved den ene metode implanteres ESCC-celler/xenografts i den øverste del af spiserøret , mens ESCC-celler/xenografts ved den anden metode implanteres i den nederste ende af spiserøret i maveregionen nær den gastroøsofageale overgang . For nylig har vi også rapporteret om en sammenligning af overlevelsen mellem dyr med ortotopisk tumor udviklet i den øvre øsofagusregion og den nedre region, og vi fandt, at dyr med tumor i maveregionen har en bedre overlevelse . Selv om det er mere tids- og arbejdskrævende at etablere ortotopiske tumorer, kan denne model rumme undersøgelse af tumorvækst i et korrekt tumormikromiljø som i den kliniske situation og gøre det muligt at studere tumor-strømsinteraktioner . Den lider imidlertid også under den samme begrænsning som den subkutane model, idet den anvender ESCC-cellelinjer som kildemateriale til tumoretablering. En anden væsentlig ulempe ved denne model er behovet for at anvende specialiserede billeddannelsesmetoder, f.eks. in vivo billeddannelsessystemet kombineret med bioluminescens-teknologi , for at overvåge tumorvæksten. På trods af disse begrænsninger gør denne models styrker den til en værdifuld dyremodel til brug i forskning på mellemlangt og langt fremme i udviklingen.

Selv om den ortotopiske xenograftmodel for tumorer giver overlegne fordele i forhold til den subkutane model, er dens anvendelse fortsat begrænset på grund af de ovennævnte begrænsninger. På trods af disse mangler har et stigende antal rapporter eksemplificeret anvendelsen af denne model til at studere ESCC-tumorigenese og til at udføre præklinisk anti-tumorigenecity-testning. Da denne model blev anvendt til at afdække den tumorundertrykkende virkning af transmembranproteasen DESC1, blev der observeret en langsommere tumorvækst ved anvendelse af DESC1-eksprimerende KYSE-150 ESCC-celler sammenlignet med kontrolceller . I en uafhængig undersøgelse, hvor denne model blev anvendt til at undersøge tumorfænotypen af en tumorrelateret proteinkinase AKT, blev der fundet en tydelig tumorundertrykkende effekt i forbindelse med knockdown af AKT, således at der let kunne påvises en reduceret væksthastighed af ortotoperede tumorer . Ud over dens anvendelse til undersøgelse af tumorvækst kan denne model anvendes til at undersøge mekanismen for tumorinvasion. En omfattende undersøgelse pegede på inddragelsen af et celleoverflademolekyle CD44H i tumorinvasionen på grundlag af de observerede invasive mønstre mellem ortotopiske tumorer, der stammer fra T.T ESCC-celler, og den invasive modpart T.T-1 ESCC-celler. T.T-1 ESCC-cellinjen udtrykte et højt niveau af CD44H og blev afledt af tumorceller isoleret fra cervikal lymfeknude i en ortotopisk xenograftmodel med T.T ESCC-celler, der stammer fra ortotopiske tumorer. Ud over at denne model anvendes til at studere tumorvækst og invasion, er den også i stand til at vurdere virkningerne af testforbindelser på overlevelsen efter behandlingen. Der blev observeret en forlænget overlevelse i ortotopiske ESCC-tumorbærende dyr efter behandling med mTOR-hæmmeren temsirolimus, som i øjeblikket anvendes til behandling af nyrecellecarcinom .

Generelt supplerer ortotopisk tumor xenograft-model den almindelige brug af subkutan model til undersøgelse af ESCC ved at give et korrekt tumormikromiljø. Desuden fungerer denne model som et uundværligt redskab i præklinisk forskning til undersøgelse af anti-tumorvirkningerne af testforbindelser/lægemidler (tabel 3).

Patientafledt tumor xenograft-model

Patientafledt tumor xenograft-model er en mere avanceret dyrecancermodel end de ovennævnte modeller til ESCC-forskning. Denne model er etableret ved hjælp af ESCC-tumorer, der er fjernet fra patienter, til udvikling af xenografts af tumorer i immundefekte dyr. Patientens tumorer kan implanteres subkutant eller ortopædisk. Afhængigt af tumorimplantationsstedet bevarer denne model også visse funktioner som de subkutane og ortotopiske xenograft-tumormodeller. Det er bemærkelsesværdigt, at tumor xenografts, der stammer fra patienttumorer, har bevarede genetiske, histologiske og fænotypiske egenskaber som donortumorer. Da stromal- og cellekomponenterne i de patientafledte tumor-xenografts er bevaret som i donortumorerne, kan brugen af denne model udelukke de ulemper, der er forbundet med brugen af homogene tumorcellelinjer. På trods af disse fordele lider denne model uundgåeligt under flere begrænsninger . Etableringen af modellen kræver, at der anvendes resected patienttumorer, hvilket nogle grundforskningslaboratorier måske ikke har adgang til denne prøvekilde. Desuden er indpodningshastigheden af patienttumorer til dannelse af xenografts suboptimal og varierer afhængigt af en række faktorer som f.eks. tumortyper, tumorimplantationssteder, musestammer, tumoregenskaber og patientegenskaber . Selv for en patienttumor, som det lykkes at få podet, kræver det en lang latensperiode at vokse til en tumor xenograft, og denne proces kan undertiden vare op til 6 måneder. Ovennævnte begrænsninger har derfor gjort tumoretableringsprocessen til en dyr og arbejdskrævende procedure. På trods af disse ulemper erstatter denne model gradvist andre kræftmodeller fra dyr til brug i forskning på mellem- og senmoderne stadier og er især nyttig til præklinisk evaluering af anti-tumoreffekten af nye stoffer/lægemidler. Faktisk omtales denne model undertiden som “kliniske forsøg i en mus” på grund af dens overlegne evne til at forudsige klinisk respons på testforbindelser/lægemidler på grund af den store lighed mellem tumor xenografts og donortumorer.

I betragtning af alle fordele og ulemper kan patientafledte tumor xenograft-modeller give os en forskningsplatform ikke kun til undersøgelse af sygdomsmekanismerne ved ESCC, men kan også lette præklinisk screening af lægemidler. Til sidstnævnte anvendelse anvendes denne model mere fortrinsvis end de subkutane og ortotopiske modeller på grund af dens høje kliniske relevans, hvilket understøtter dens anvendelse til evaluering af anti-tumorvirkningerne af nye forbindelser/lægemidler. På dette område har de enkelte forskergrupper etableret deres egne samlinger af patientafledte xenograft-tumormodeller med bevaret tumorheterogenitet til screening af lægemidler eller lægemiddelkombinationer mod ESCC (tabel 4).

De patientafledte tumor xenograftmodeller med velkarakteriserede molekylære dereguleringer, der almindeligvis findes i ESCC, kan anvendes som et redskab til afprøvning af aktuelt anvendte lægemidler med henblik på deres nye anvendelser på ESCC. Denne proces er vigtig, da den kan bruges til forskning efter nye lægemidler til patienter, der er resistente over for de nuværende lægemiddelbehandlinger. Cisplatin og 5-fluorouracil er to kemoterapeutiske lægemidler, der anvendes til behandling af ESCC, men det er ikke alle patienter, der reagerer godt på lægemidlerne. For at få en bedre forståelse af lægemiddelmekanismen etablerede Zhang et al. et panel af patientafledte xenograft-tumormodeller og karakteriserede dem for almindelige genetiske aberrationer, der ofte påvises i ESCC, såsom HER2-ekspression og mutationer af EGFR (epidermal vækstfaktorreceptor), K-ras, B-raf og PIK3CA (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat 3-kinase katalytisk underenhed alfa). Ved hjælp af et panel af xenografts med velkarakteriseret HER2- og PIK3CA-status til undersøgelse af behandlingseffekten af cisplatin og 5-fluorouracil var tumor xenografts negative for HER2 og med wild-type PIK3CA mere følsomme over for en sådan behandling sammenlignet med HER2-positive xenografts uanset PIK3CA-mutationens status . Resultaterne fra denne undersøgelse har afsløret forbindelsen mellem tumorens genetiske sammensætning og kemoterapeutiske lægemidlers respons.

Selvom brugen af patientafledte tumor xenograftmodeller med definerede genetiske sammensætninger til afprøvning af konventionelle kemoterapeutiske lægemidler er disse modeller blevet brugt til at undersøge anti-tumorvirkningerne af lægemidler, der ikke anvendes klinisk til ESCC, såsom trastuzumab og lapatinib. Afprøvning af virkningen af trastuzumab på patientafledte tumor xenografts viste, at HER2-positive ESCC reagerede på en sådan behandling, men ikke for dem, der samtidig havde en PIK3CA-mutation. Yderligere behandling af disse HER2-positive og PIK3CA-muterede tumor xenografts med AKT-hæmmeren AZD5363 gjorde efterfølgende xenografts til at reagere på trastuzumab-behandling igen . En anden undersøgelse undersøgte den sensibiliserende virkning af lapatinib på kemoterapeutiske lægemidler oxaliplatin eller 5-fluorouracil ved hjælp af en patientafledt tumor xenograft-model. Kombineret behandling af lapatinib med 5-fluorouracil førte til en mere potent væksthæmmende effekt end lapatinib alene eller dets kombinerede behandling med oxaliplatin . Disse undersøgelser har klart vist, hvor nyttige disse modeller er til præklinisk lægemiddelafprøvning. Det er vigtigt, at en sådan afprøvning på tumor xenografts med definerede genetiske baggrunde kan lette udviklingen af præcisionsmedicin ved at vælge lægemiddelbehandling baseret på tumorernes genetiske dereguleringer.

Patientafledte tumor xenograftmodeller kan efterligne den genetiske diversitet og sammensætning i de kliniske omgivelser på grund af den høje histologiske og patologiske relevans mellem donortumorer og de etablerede tumor xenografts. Disse tidligere undersøgelser har fremlagt den prækliniske anvendelse af disse modeller til evaluering af forskellige lægemidlers/forbindelsers anti-tumoreffektivitet (tabel 3). De afledte resultater kan også give solide beviser til støtte for anvendelsen af nye lægemidler/forbindelser til behandling af ESCC. Sådanne prækliniske test udgør derfor en vigtig platform forud for kliniske forsøg.