Valenciansk Institut for Mikrobiologi(I V A M I)

admin

Clostridium botulinum – Botulisme (kliniske former). Test til diagnosticering af botulisme. Påvisning af toksin i patienter, fødevarer, foder, slam eller vandsedimenter; vandfugle, andre prøver. Anbefalede test: påvisning af toksin, C. botulinum-kultur, typet botulinumtoksin; molekylær diagnose (PCR).

Karakteristika for Clostridium botulinum og botulinumtoksin/s

Clostridium botulinum er en streng anaerob grampositiv bacille, slægten Clostridium, familien Clostridiaceae, sporedannende, der producerer et neurotoksisk toksin. Denne bakterie findes normalt i jord og ubehandlet ferskvand og sedimenter (oceaner, søer) og har en verdensomspændende udbredelse. Under visse omstændigheder kan denne organisme kontaminere fødevarer og vokse i dem for at producere deres toksin(er). Botulisme, en alvorlig form for fødevareforgiftning, opstår ved indtagelse af fødevarer, der indeholder toksinet. Selv om denne sygdom er sjælden, er dødeligheden høj. Da toksintypen blev bestemt blandt de 1036 tilfælde, der blev konstateret i USA mellem 1899 og 1990, var 384 tilfælde af A-toksin, 106 tilfælde af B-toksin, 105 tilfælde af E-toksin og 3 tilfælde af F-toksin. Undertiden kan der være tilfælde, der skyldes to to toksiner, f.eks. A og B.

Alle former for botulisme hos mennesker og dyr skyldes optagelse af botulinumtoksin, der dannes under formering af bakterien Clostridium botulinum. Toksinet har en meget høj toksicitet (neurotoksicitet), så det udøver sin virkning ved ekstremt lave niveauer, er termolabilt, mens bakteriens sporer er varmebestandige og overlever i fødevarer, der er opvarmet til over 100 ºC, f.eks. konserves under varmebehandling. Desuden kan nogle stammer af C. botulinum, C. butyricum, C. baratii og C. argentinense producere botulinum neurotoksiner.

Der findes syv toksintyper (A – G), der kan differentieres ved neutraliseringstest, og som er nyttige for klinisk og epidemiologi. Type A, B, E og F er de vigtigste årsager til botulisme hos mennesker, mens type C og D findes i tilfælde af botulisme hos dyr, hvor de mest berørte er vilde fugle og fjerkræ, kvæg, heste og visse fiskearter. Type A og B er de mest almindelige hos mennesker og er hovedsagelig forbundet med forurening af hjemmelavede grøntsagskonserves, men i Europa er disse typer også blevet fundet i forbindelse med kødprodukter. E-typen (fisk) findes i vandmiljøer og korrelerer med E-botulismetilfælde vedrørende kontamineret fisk eller skaldyr, og den er stigende. F-typen er en undtagelse. Type C er underopdelt i C1 (neurotoksin) og C2 (ikke neurotoksin påvirker vaskulær permeabilitet og enterotoxigene). G-typen produceres af C. argentiniense (isoleret fra jord i Argentina, serum fra afdøde patienter, selv om det er uklart medvirken).

Toksiner syntetiseres under bakteriens vækst som et inaktivt protein (150 kDa), som frigives fra bakterien under lysis. For at aktivere det dannede toksin skal det nedbrydes i to polypeptidkæder (50 og 100 kDa).

C. botulinum, kan differentieres i grupper i henhold til deres kulturkarakteristika, biokemiske og fysiologiske. Alle kulturer type A og nogle af type B og F er proteolytiske. Kulturer af C. botulinum-toksiner produceret af C og D er ikke proteolytiske, når de dyrkes i et medium med koaguleret æggehvide eller kød. Alle typerne E og nogle af typerne B og F er ikke-proteolytiske, men har karakteristika ved kulhydratmetabolismen, der adskiller sig fra de ikke-proteolytiske grupper af typerne C og D. Stammerne af type G har ikke Det er blevet undersøgt tilstrækkeligt detaljeret til en effektiv og tilfredsstillende karakterisering.

Den optimale temperatur for vækst og toksinproduktion er ca. 35ºC for de proteolytiske stammer; for de ikke-proteolytiske stammer er 26-28ºC. Ikke-proteolytiske stammer af type B, E og F kan producere toksin ved køletemperaturer (3-4ºC). Toxiner fra ikke-proteolytiske stammer udviser ikke maksimal toksicitet før aktivering af toksin med trypsin. Toxiner fra proteolytiske stammer produceres generelt i aktiveret form.

Kliniske former for botulisme

Der findes fire kliniske former for botulisme hos mennesker:

  • Fødevareforgiftning (fødevarebåren botulisme), som skyldes indtagelse af fødevarer forurenet med Clostridium botulinum, hvori der dannes toksin.
  • Sårbotulisme, fremkaldt ved infektion af sår med Clostridium botulinum og udvikling af toksin in vivo efter vækst af bakterierne i såret.
  • Spædbarnsbotulisme, fremkaldt ved produktion af toksin i fordøjelseskanalen hos små børn koloniseret med Clostridium botulinum (den mest almindelige årsag skyldes indtagelse af forurenet honning eller majssirup), efterfulgt af absorption af toksinet. Disse patienter kan have antistoffer mod toksinet.
  • Voksen tarmbotulisme, forårsaget af kolonisering af fordøjelseskanalen med Clostridium botulinum hos ældre, efterfulgt af absorption af toksinet. Disse patienter kan have antistoffer mod toksinet.

I enhver af de kliniske former for human botulisme og lige så meget i den animalske botulisme trænger toksinet ind i blodet fra mave-tarmkanalen, når det indtages præformet med en fødevare, eller når det produceres af den bakterie, der koloniserer fordøjelseskanalen (små børn eller voksne), eller i undtagelsestilfælde børn fra et inficeret sår med bakterien. Der er nogle fødevarer, som er mere tilbøjelige end andre til at indeholde botulinumtoksin. Fødevarer med en pH-værdi på under 4,5 er vanskeligere at være årsag til botulisme, da C. botulinum ved denne pH-værdi ikke er i stand til at formere sig og producere toksin (dette er tilfældet med frugtsaft, eddikemarineret mad osv.). Omvendt kan fødevarer med pH lig med eller højere end 4,5 forårsage botulisme, da det i dem er muligt at formere sig og producere toksin (dette er tilfældet med kød, fisk, grøntsager, færdigretter osv.), på alle disse fødevarer iltfri eksponering, som ved konserverede eller vakuumpakkede fødevarer, og som har en pH på over 4,6. Som eksempler på farlige fødevarer kan nævnes: saltet skinke, røget, fisk eller grøntsager på dåse (der har været udsat for en varmebehandling, som ikke er tilstrækkelig til at dræbe sporer) osv. De dåser, der er kontamineret med C. botulinum, er normalt buede, selv om dette ikke sker med type E.

Det absorberede toksin binder sig irreversibelt til de neuromuskulære forbindelser i motoriske neuroner, hvilket forhindrer frigivelsen af acetylcholin og forårsager slap lammelse eller muskelsvaghed.

Klinisk er karakteriseret ved akut slap lammelse, som normalt begynder med bilateral involvering af kranienerverne, der påvirker musklerne i ansigtet, hovedet og svælget, og derefter nedadgående symmetrisk for at påvirke brystmusklerne og lemmerne. Døden, når den indtræffer, skyldes respirationssvigt som følge af lammelse af tunge- og svælgmusklerne, der blokerer de øvre luftveje, eller som følge af lammelse af diafragma og interkostalmusklerne. Derfor bør patienterne modtage botulinum antitoksin og respiratorisk intensivbehandling er nødvendig.

Diagnostiske test for botulisme

Detektion af botulinumtoksin i prøver eller fødevarer uden dyrkning (se anbefalet prøve i afsnittet om test “Test tilbudt af IVAMI og krævede prøver”).

Dette anbefales hos en patient med kliniske tegn på botulisme.

Detektion af botulinumtoksin kan udføres i en væske som f.eks. serum, der er udtaget fra blod. Det kan også påvises fra rester af madrester, der er spist, som har forårsaget et tilfælde eller et udbrud af botulisme. For at udføre testen ved hjælp af levnedsmiddelrester er det nødvendigt at få et ekstraktfiltrat fra disse. I tilfælde af botulisme hos spædbørn eller tarmbotulisme kan der påvises toksin i afføring fra børn eller patienter, men det er mere tilrådeligt at foretage en foreløbig dyrkning af afføring (se nedenfor ). Påvisning af botulisme-toksin i alle tilfælde foretages ved inokulation i mikrofoner, der udvikler paralytiske symptomer efterfulgt af død, hvis de inokuleres med botulinumtoksin. For at bekræfte, at musene er døde af det inokulerede botulinumtoksin, er det nødvendigt med en neutraliseringstest, som bekræfter, at der var botulinumtoksin til stede, og som identificerer typen af det tilstedeværende botulinumtoksin. Denne neutraliseringstest udføres over for det inokulerede produkt (person- eller dyreserum, ekstrakt fra indtaget føde, …) over for specifikke antisera af hver enkelt toksintype.

Forud for neutraliseringstesten er det nødvendigt at beregne den mindste dødelige dosis (MLD). Således beregner vi den maksimale (højeste) fortynding, der forårsager de inficerede dyrs død, og det inokulerede volumen har forårsaget dyrenes død indeholder en dødelig minimumsdosis (LMD).

For at identificere toksintypen, når først den “Minimum Letal dosis” er kendt, står denne over for forskellige anti-toksin botulinum type antisera. Disse blandinger vil blive inokuleret i lige store mængder til forsøgsmus, og de, der overlever, er blevet inokuleret med blandingen af “minimum letal dosis” plus antiserum mod en type, der har været i stand til at neutralisere.

Detektion af toksin i prøver/produkter efter forkultivering (se Anbefalet prøve efter i den af IVAMI udbudte test og krævede prøver).

Når bakterien Clostridium botulinum, som producerer toksinet, kan findes i prøven, anbefales det forudgående dyrkning, at undersøge toksinet efter at have dyrket prøven. Dette er tilfældet med afføring fra en patient med spædbarnsbotulisme eller tarmbotulisme, rester af fødevarer, der er spist, hvori der havde formeret sig bakterier (f.eks. dåsekonserves), en mistænkt fødevare, der kan indeholde bakterien (f.eks. en bulet konserves), en fødevare, der er under kontrol for at udelukke tilstedeværelsen af denne bakterie (f.eks, pølser, skinker, dåser) eller andre prøver, f.eks. ferskvandsslam eller akvatiske havsedimenter osv. fra områder, hvor der er observeret dødelighed hos vandfugle.

Ved dyrkning i laboratoriet i egnede dyrkningsmedier produceres toksinet, hvis der er en bakterie, og det kan være nyttigt at opnå et kulturfiltrat til undersøgelse af dets tilstedeværelse ved at inokulere filtratet til mus. Hvis de inokulerede mus påvirkes, kan det sandsynlige forekomst af Clostridium botulinum i prøven eller vækst i kultur angives. Musene kan imidlertid være døde af en anden årsag, så det er nødvendigt, inden rapporten udfærdiges, at kontrollere, at de virkelig er døde for at være blevet inokuleret med botulinumtoksin.

For at bekræfte tilstedeværelsen af botulinumtoksin i kulturen kan der udføres neutraliseringstest ved hjælp af specifikke antisera for hver type botulinumtoksin (neutraliseringstest) eller påvisning af tilstedeværelsen af Clostridium botulinum-gener og dets type i kulturmediet (molekylær påvisning ved PCR).

Neutraliseringstest udføres over for den inokulerede prøve (kulturfiltrat) over for specifikke antisera for hver toksintype.

Forud for neutraliseringstesten er det nødvendigt at beregne den mindste dødelige dosis (MLD). Således beregnes den (højeste) maksimale fortynding, der forårsager de inokulerede dyrs død, og den inokulerede mængde har forårsaget dyrenes død indeholder en mindste dødelig dosis.

For at identificere toksintypen, når først “mindste dødelige dosis” er kendt, foretages konfrontation af den mindste dødelige dosis med forskellige typer anti-botulinum-sera. Disse blandinger inokuleres i lige store mængder til forsøgsmus, og de, der overlever, er blevet inokuleret med blandingen af “minimum lethal dose” plus antiserum mod en type, der har været i stand til at neutralisere.

Den molekylære påvisning ved PCR undgår den tid, der er nødvendig til beregning af minimum lethal dose (MLD) og neutraliseringstest.

Detektion af anti-botulinumtoksin-antistoffer (se anbefalet prøve efter i afsnittet Test, der tilbydes af IVAMI, og nødvendige prøver)

  • Patienter, der behandles med fortyndet botulinumtoksin, f.eks. patienter, der modtager botox til æstetiske eller medicinske behandlinger (f.eks. gr. smerter på grund af facial trigeminusneuralgi), for at påvise tilstedeværelsen af antistoffer, der forhindrer dets virkning.
  • Patienter med mistanke om botulisme hos spædbørn eller botulisme hos voksne, som ikke har været i stand til at finde bakterien Clostridium botulinumtoksin i afføring eller serum.
  • Vaccinerede personer, der er interesseret i at kontrollere status for beskyttelsen.

Clostridium botulinumtoksin har i meget høje fortyndinger været anvendt ved lokal administration til behandling af spastiske processer. Disse processer har vist sig at være et nyttigt middel. Disse processer er normalt kronisk spastiske og kræver således, at toksinet administreres permanent. Der kan derfor opstå resistens under behandlingen som følge af progressiv immunisering af patienten under hele behandlingen, og i så fald vil virkningen være begrænset. For at påvise denne immunisering er det nødvendigt at måle nøjagtigt og følsomt, om der findes antistoffer mod botulinumtoksin A og/eller B.

Den anerkendte referencemetode til påvisning og kvantificering af antistoffer mod botulinumtoksin er neutraliseringstesten i mus (Mouse Neutralization Assay), hvor en fortynding af botulinumtoksin, kvantificeret ved Lethal Dose 50% for mus (DL50), blandes med forskellige base 2- eller base 4-fortyndinger af serum/plasma, og efter inkubation inokuleres de hver især intraperitonealt til grupper af mus. Den højeste fortynding af testserum, der reducerer toksiciteten, svarer til antistoftiteren mod det tilsvarende botulinumtoksin. Denne fortynding, sammenlignet med en international standard, gør det muligt at opnå resultater i internationale enheder (IU/mL) (1 IU er defineret som den mængde antistof, der neutraliserer 10 000 LD50 af toksin A eller B eller 1000 LD50 af type E). Den mængde toksin, der anvendes i testene, er en mængde, der neutraliseres af 0,02, 0,005 og 0,0125 IU/mL antitoksin for henholdsvis type A, B og E (Hatheway et al. 1984). Sera, der beskytter musenes titer på 1: 4, rapporteres som <0,08 IU / mL for type A, eller <0,02 IU / mL for type B. Testen er besværlig, dyr og lang varighed udføre, så alternativer er blevet søgt enmzimoinmunoanálisis baseret metoder (ELISA) ved hjælp af mikroplader belagt med botulinumtoksin. De værdier, der opnås ved ELISA, korrelerer dog undertiden ikke fuldt ud med neutraliseringstesten i mus.

Forud for neutraliseringstesten er det nødvendigt at beregne den mindste dødelige dosis (DLM) af toksin. Beregningen af den mindste letale dosis foretages ved base 10-fortyndinger af kulturfiltratet, fortynding af halvdelen med fysiologisk saltvand for at opnå samme fortynding som toksinet blandet med serum eller plasma fra patienten og inokulering af hver fortyndingsblanding til laboratoriemus. På denne måde beregnes den (højeste) maksimale fortynding, der forårsager de inficerede dyrs død. Den inokulerede mængde, der har forårsaget dyrenes død, indeholder en mindste dødelig dosis (MLD).

Når den mindste dødelige dosis er kendt, beregnes den mindste ikke-dødelige dosis (dmnm), der svarer til den mindste mængde toksin i tilstedeværelse af en konstant mængde antitoksin, som ikke dræber inokulerede mus. Denne mængde toksin neutraliseres af de tilsvarende enheder af anti-A-antitoksin eller anti-B-antitoksin. Mindste ikke-dødelige dosis kaldes det, fordi det er den mindste mængde toksin, der ikke medfører, at musene dør i tilstedeværelse af antitoksin .

Test, der tilbydes af IVAMI, og nødvendige prøver:

  • Detektion af botulinumtoksin i menneskelige tilfælde eller udbrud af fødevarebåren botulisme:
    • Patientserum (mindst 5 mL), der senest er fremstillet til inokulering til mus og toksintypebestemmelse, hvis musene blev påvirket.
    • I tilfælde af botulisme hos spædbørn eller tarmbotulisme kan botulinumtoxinet påvises i afføring hos børn/patienter, men vi anbefaler mere tilrådeligt at foretage en forudgående dyrkning af afføring.
    • Detektion af toksin og/eller Clostridium botulinum i indtagne fødevarer, der mistænkes for at forårsage botulisme, eller fødevarer, der er underlagt kontrol
      • Prøve af den mistænkte eller kontrollerede fødevare (mindst ca. 100 gram anbefales) for at forberede en prøve beregnet til inokulering af mus og påvisning af tilstedeværelsen af det præformede toksin i fødevarer, samt til udførelse af en dyrkning for at opnå filtratet til inokulering af mus og til bestemmelse af, om der var en toksinproducerende bakterie i prøven; Hvis man kun har rester af fødevarer, anbefales det at sende hele den disponible mængde.
    • Detektion af Clostridium botulinum i tilfælde af spædbarnsbotulisme eller tarmbotulisme
      • Feces i tilfælde af spædbarnsbotulisme eller tarmbotulisme som følge af tarmkolonisering (10 g), til dyrkning og toksindetektion i kulturfiltrat ved inokulering af mus.
    • Detektion af Clostridium botulinum i tilfælde af sårbotulisme
      • Sårekssudat i tilfælde af mistanke om sårbotulisme, til dyrkning og toksindetektion i kulturfiltrat ved inokulering af mus. Hvis prøven transporteres aerobt, kan Clostridium botulinum være blevet inaktiveret, og det ville være mere hensigtsmæssigt at udføre en molekylær test for tilstedeværelsen af Clostridium botulinum-gener og, hvis den er positiv, identificere botulinumtoksin-typen ved at påvise gener svarende til hver enkelt toksintype.

    • Detektion af Clostridium botulinum i prøver af ferskvandsslam eller akvatiske havsedimenter og andre produkter, der ikke er omfattet af de foregående afsnit
      • 100 g prøver ca. til udførelse af en kultur for vækst af Clostridium botulinum og opnåelse af et kulturfiltrat til inokulering af mus.
    • Detektion af anti-botulinumtoksin-antistoffer i serum eller plasma
      • Serum eller plasma (ca. 10 mL), for at undersøge for neutraliseringsantistoffer i serum eller plasma mod forskellige toksiner, der er til rådighed i laboratoriet. Denne test er af interesse for at bestemme tilstedeværelsen af specifikke antistoffer hos personer, der er behandlet med botulinumtoksin, hos patienter med mistanke om botulisme hos spædbørn, hos voksne, der ikke har været i stand til at finde bakterien i afføringen, eller hos vaccinerede personer for at kontrollere beskyttelsens status. I tilfælde af personer, der er behandlet med botulinumtoksin Det skal angives, hvilken type toksin patienten er blevet indgivet.

    Tid for indberetning af resultater (TAT)

    • Vi kan ikke give nøjagtige tider. Hvis der kun testes for påvisning af toksin ved inokulation af mus, og resultatet er negativt, vil der højst være en uges tid til indberetning af resultaterne. Hvis testningen omfatter dyrkning af prøven og derefter påvisning af det toksin, der er fremstillet ved inokulering af et kulturfiltrat af mus, vil tiden være to uger. Hvis nogen af disse test mus inokulation, ekstrakt fra en prøve eller kulturfiltrat, var positive, bør neutraliseringstest udføres i mus til at bekræfte, at er botulinumtoksin og identificere dens type ved neutraliseringstest, færdiggørelsestiden er 15 dage.
    • Real time PCR tests rapporten er i 3 eller 4 dage.

    Formular med produktkarakteristika og den/de valgte test(er)

    • Hvis der ansøges om at udføre test med produktet skal der indsendes et brev, hvori produktkarakteristika og de valgte test, der skal udføres med den tilsendte prøve, fremgår.

    Prøvens omfang

    • Se i hvert enkelt tilfælde, afhængigt af den type test, som IVAMI tilbyder.

    Lagringsbetingelser og forsendelse af prøver

    • De sendes på de betingelser, som prøven normalt befinder sig under, beskyttet til transport. I tilfælde af prøver, der kan nedbrydes, fordi det er forurenet med bakterier, eller af sin egen organiske (letfordærvelige varer, sera fra dyr eller mennesker, afføring, slam, … …), skal prøverne opbevares og sendes frosset, eller i det mindste under de betingelser, der sikrer køling under transport (med prøvebeholderen inde i en kasse -ekspanderet polystyren- (hvid kork) med kølepakker frosset. Bemærk: denne organisme udgør i sig selv ikke en risiko for kontaminering ved biologisk eksponering.

    Kostprøvning

    • Toksindetektion i humane tilfælde/udbrud af fødevarebåren botulisme
      • Mus inokulering med serum fra patienten eller ekstrakt fra indtaget mad ………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………Konsult [email protected]
    • Hvis det er positivt, konfirmatorisk test for neutralisering og identifikation af toksintype …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konsultere [email protected] .
    • Detektion af toksin og/eller Clostridium botulinum i fødevarer, der indtages, mistænkes for at forårsage botulisme, eller fødevarer, der er underlagt kontrol
    • Detektion af Clostridium botulinum i tilfælde af botulisme hos spædbørn eller tarmbotulisme
      • Optionel: Inokulationstest for mus med serum eller ekstrakt fra indtaget føde ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Konsultere [email protected]
      • Anbefales. Kulturtest efterfulgt af inokulering af mus med kulturfiltrat ………………………….. ………………………………………………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
      • Hvis den er positiv, bekræftelsestest for neutralisering og identifikation af toksintype ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Konsult [email protected]
    • Detektion af Clostridium botulinum i tilfælde af sårbotulisme
      • Kulturtest, efterfulgt af inokulering af mus med kulturfiltrat ……………………. Konsultere [email protected]
      • Hvis den er positiv, konfirmatorisk test for neutralisering og identifikation af toksintype …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Kontakt [email protected]
    • Detektion af Clostridium botulinum i prøver af slam/sødt vand eller marine sedimenter og andre produkter, der ikke er omfattet af de foregående afsnit
      • Kulturtest, efterfulgt af inokulering af mus med kulturfiltrat ……………………. Konsultere [email protected]
      • Hvis den er positiv, bekræftelsestest for neutralisering og identifikation af toksintype ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Konsultere [email protected]
    • Detektion af anti-botulinumtoksin i serum eller plasma (henviser til en type antistof, så det skal angives, hvilken type toksin der er indgivet til den pågældende) ……………………………………………….. Consult [email protected]

    Skriv et svar

    Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.