Wood Frog Freezing Survival
Winter Habitat
Træsfrøen (Rana sylvatica) lever i skove fra Appalacherne til de maritime provinser og vestpå til det nordlige Alaska og endda til polarcirklen. Dens overvintringssted er en lavvandet hule i skovbunden, et godt stykke inde i frostzonen, som er dækket af blade og andet organisk detritus. Vores undersøgelser i det sydlige Ohio tyder på, at skovfrøer udsættes for flere fryseepisoder, der typisk varer flere dage og udsætter frøerne for temperaturer, der falder så lavt som -2° til -4°C; i mere nordlige områder oplever de dog sandsynligvis meget lavere temperaturer og længere frostperioder.
Initiering af frysning
Flere mekanismer sikrer, at skovfrøer fryser uden at underkøle i stor udstrækning. For det første kan is omkring frøen på grund af paddehudens meget permeable natur straks udløse frysning af kropsvæskerne. Desuden er frøens vinterrefugium vært for en overflod af iskernedannende stoffer, såsom forskellige mineralpartikler, organiske syrer og visse mikrober, som kan få frøen til at fryse. Laboratorieforsøg tyder på, at indtagelse af disse stoffer fremmer isdannelsen hos fryse-tolerante frøer. Der er faktisk blevet dyrket flere bakteriestammer, der udtrykker en kraftig iskernedannende aktivitet, fra tarmene af vinterfangede skovfrøer, hvilket tyder på, at sådanne bakterier bevares under hele vinterdvalen (Lee et al. 1995). Inokulation med is eller iskernedannende stoffer i vintermiljøet er sandsynligvis den primære mekanisme, der initierer frysning hos padder; der er ikke behov for iskernedannende proteiner eller andre endogene iskerner, som det findes hos nogle hvirvelløse dyr (Costanzo et al. 1999).
Freeze/Thaw Stresses
Intensiv frysning størkner væv, stopper den vaskulære cirkulation og fratager cellerne ilt. Da is kun dannes i de ekstracellulære rum, bliver vand inde i cellerne osmotisk trukket udad, hvor det slutter sig til det voksende isgitter. Under denne proces kan cellerne skrumpe betydeligt, hvilket kan medføre skader på membraner og strukturelle støttesystemer. Makromolekyler og opløste stoffer bliver trængt sammen i et mindre opløsningsvolumen, hvilket kan have negative konsekvenser. Isdannelse i kropsvæsker udgør også en trussel om mekanisk skade fra det voksende isgitter, især i kompakte og stærkt strukturerede væv og organer. Isfronter kan skære og adskille væv og forstyrre de intercellulære kommunikationssystemer. Ved optøning dannes der store puljer af fortyndet væske i de ekstracellulære rum. Cellevolumen, hydroosmotisk balance og energistatus skal genoprettes.
Frysetolerancekapacitet
Laboratorieundersøgelser har vist, at skovfrøer kan overleve: (a) nedfrysning af op til 65-70% af deres kropsvand, (b) en minimumskropstemperatur på -6°C, og (c) uafbrudt nedfrysning i ≥ 4 uger. Fristetolerancen varierer efter årstiden, da frøer er mest hårdføre om vinteren. En sådan sæsonbestemt variation i frysetolerancekapacitet kan delvis afspejle ændringer i mængden af kryoprotektant, der kan produceres. Overlevelse afhænger af langsom nedfrysning, så de kryobeskyttende mekanismer kan komme mere fuldt ud til udtryk.
Frostgenopretning
Genopretning er bemærkelsesværdigt hurtig, og de grundlæggende fysiologiske og adfærdsmæssige funktioner vender normalt tilbage inden for flere timer efter optøning (link til video med lav båndbredde/stor båndbredde; link til NOVA scienceNOW-historie).I samarbejde med Jack R. Layne, Jr. (Slippery Rock University) har vores arbejde vist, at genoprettelsesdynamikken er kendetegnet ved en sekventiel genoprettelse af grundlæggende til gradvist mere komplekse funktioner. F.eks. begynder hjertet at slå igen, endnu før isen i kroppen er smeltet helt, og lungeåndedrættet og blodcirkulationen genoprettes kort efter. Kontraktiliteten i baglårsmusklerne vender tilbage 1-2 timer efter optøning, mens funktionen af den innerverende iskiasnerve genoprettes inden for ca. 5 timer. Baglårets tilbagetræknings- og retningsreflekser vender tilbage flere timer senere, og frøerne viser normalt normale kropsholdninger og koordinerede motoriske funktioner inden for 14-24 timer. Adfærd af højere orden, såsom parringsdrift og kurtiseringsadfærd, genoprettes først mindst flere dage senere (Costanzo et al. 1997).
Tilpasninger til fryse-tolerance
En reaktion, der fremmer fryse-tolerance hos fryse-tolerante frøer, er omfordeling af op til 60% af det vand, der normalt findes i vævene. Ved at dissekere en frossen frø viser det sig, at en stor del af isen er lagret i lymfesystemet og i coelom, hvor den kan dannes uden at beskadige sarte væv og organer (Lee et al. 1992).
Frysetolerance fremmes også af den hurtige syntese af glukose fra leverglykogen og fordelingen af dette kryobeskyttende middel til celler i hele kroppen. Den akkumulerede glukose forbedrer tilsyneladende cellernes, vævenes og organernes overlevelse, da eksperimentel tilførsel af ekstra glukose til frøen øger dens tolerance over for frysning (Costanzo et al. 1993). En af glukosens primære funktioner er at øge det osmotiske tryk i kropsvæskerne, hvilket igen reducerer den mængde is, der dannes ved en given temperatur. Glukose, der transporteres ind i cellerne, fungerer som en osmolyt, hvilket mindsker graden af celleskrumpning under frysning, og det fungerer også som et gærbart brændstof, der kan metaboliseres i fravær af ilt. Skovfrøen bruger også urea som et kryobeskyttende middel. I modsætning til glukose ophobes urea i løbet af efteråret og den tidlige vinter og er allerede lokaliseret i cellerne, når frysningen begynder. Noget tyder på, at urinstof er mere effektivt end glukose til at forebygge kryoskader (Costanzo og Lee 2005).
Aquaporiner (AQP’er) og faciliterende urinstoftransportører (UT’er) er to transportproteiner, der er blevet impliceret i en lang række fysiologiske roller i forskellige organismer. For nylig er disse proteiner blevet fundet i en række anuraner; deres fysiologiske betydning er dog endnu ikke fuldt ud forstået. For at belyse betydningen af AQP’er og UT’er i osmolytbalancen hos frøer i vinterdvale undersøger vi ekspressionen af disse proteiner hos frøer med forskellige grader af terrestrialisme. Desuden måler vi sæsonmæssige variationer i ekspressionen samt ændringer i ekspressionsniveauet som reaktion på vinterrelaterede stressfaktorer hos skovfrøen.