Abstract

Virkningerne af zink, magnesium og calcium i sædplasma på tiden til graviditet (TTP) hos raske par, på konventionelle sædparametre og parametre for computerassisteret sædanalyse (CASA) blev evalueret. Lokaliseringen af chelaterbare zinkioner i seminalplasma og spermatozoer blev vurderet ved hjælp af autometallografi (AMG). Forskelle i chelaterbar zinklokalisering i prøver med højt og lavt totalzinkindhold blev evalueret. Sædprøver fra 25 par med kort TTP og 25 par med lang TTP blev underkastet konventionel sædanalyse, CASA, zink- og magnesiummålinger ved induktivt koblet plasmamassespektrometri og calcium ved flammeatomabsorptionsspektrometri. Kationerne var stærkt indbyrdes korreleret, men der blev ikke fundet nogen korrelation med TTP eller konventionelle sædparametre. Sædprøver med høje zinkkoncentrationer udviste statistisk signifikant dårligere motilitet vurderet ved hjælp af CASA-parametrene straight line velocity og linearitet end prøver med lavt zinkindhold. Calciumkoncentrationen viste også statistisk signifikante forskelle for de samme parametre, men effekten blev fjernet ved at indtaste zinkkoncentrationen i en multipel regressionsmodel. Sædprøver med høj total zinkindhold udviste stærkere farvning af sædplasmaet ved AMG. Det antydes, at høje seminale zinkkoncentrationer har en undertrykkende virkning på spermatozoernes progressive bevægelighed (`kvaliteten af bevægelse’), men ikke på procentdelen af bevægelige spermatozoer (`kvantiteten af bevægelse’).

Indledning

Det samlede zinkindhold i sæd fra pattedyr er højt, og zink har vist sig at være afgørende for spermatogenesen. Mangel på zink er forbundet med hypogonadisme og utilstrækkelig udvikling af sekundære kønskarakteristika hos mennesker (Prasad, 1991), og kan forårsage atrofi af de seminifere tubuli hos rotter og dermed manglende sæddannelse (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Høje zinkkoncentrationer er blevet rapporteret til at nedsætte iltoptagelsen i sædcellen (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990) og den albumininducerede akrosomreaktion (Foresta et al., 1990). Hovedsvansens tilhæftning/aftagning og kernekromatinkondensering/afkondensering påvirkes også af sædcellezink (Kvist, 1980; Bjorndahl og Kvist, 1982). Der har været modstridende rapporter om virkningen af zink i sædcellerne på sædmotiliteten (Stankovic og Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). Det er blevet påvist, at chelatering af zinkioner påvirker sædmotiliteten (Saito et al., 1967; Danscher og Rebbe, 1974), og det er blevet foreslået, at biotilgængelig zink bundet til vesikulære proteiner med høj molekylvægt snarere end den samlede seminale zink bør være et mål for zinks virkning på sædets funktion (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Denne undersøgelse fokuserer primært på zink. Sammenhængen mellem zink i sædcellerne, og til en vis grad magnesium og calcium, og tid til graviditet (TTP) hos raske par blev evalueret. Endvidere blev sammenhængen mellem disse divalente kationer og konventionelle sædparametre og parametre for computerassisteret sædanalyse (CASA) vurderet.

Autometallografi (AMGZn) er en histokemisk metode til påvisning af zinkioner og løst bundne zinkioner (chelaterbar zink) i væv. Forskelle i zinkionlokalisering på lysmikroskopisk og elektronmikroskopisk niveau i spermatozoer og seminalplasma fra mænd med høj totalzink og lav totalzink blev undersøgt.

Materialer og metoder

Studiepopulation

I alt 430 par blev rekrutteret blandt 52 255 medlemmer af fire fagforeninger. Der blev udtaget sædprøver fra de 430 par, motiliteten blev vurderet manuelt og ved hjælp af CASA (se senere), og prøverne blev opbevaret frosset (-20 °C) indtil videre analyse. Par uden tidligere reproduktiv erfaring blev tilmeldt, når de afbrød prævention og blev fulgt i mindst seks komplette menstruationscyklusser eller indtil graviditet blev erkendt . Af de 430 par blev 50 par, der blev gravide, udvalgt til den foreliggende undersøgelse: de 25 par med den korteste TTP (S-TTP, median 1 måned, interval 1-2 måneder) og de 25 par med den længste TTP (L-TTP, median 10 måneder, interval 7-28 måneder). Sædprøver fra disse 50 par blev underkastet nedenstående analyser.

Konventionelle sædkarakteristika

Sædprøver blev udtaget ved onani i 50 ml sterile polystyrenkrus efter anbefalet 3 dages afholdenhed. Efter væskeopløsning blev prøverne analyseret ved stuetemperatur i overensstemmelse med Verdenssundhedsorganisationens kriterier (1992).

Volumen blev målt i et 10 ml gradueret Falcon-glasrør (0,1 ml nøjagtighed). Der blev foretaget manuelle vurderinger af sædmotilitet i et Makler-tællekammer (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel). Hver sædcelle, der blev fundet, blev klassificeret som følger: a: hurtig progressiv motilitet, b: langsom eller træg progressiv motilitet, c: ikke-progressiv motilitet, d: immotilitet. Der blev foretaget mindst 2×100 scoringer. Hvis forskellen mellem to på hinanden følgende tællinger var større end 10 %, blev der foretaget to nye tællinger. Procentdelen af bevægelige sædceller blev defineret som grupper `a + b + c’. Koncentrationen blev målt i et Makler-tællekammer, og morfologien blev klassificeret i henhold til Tygerbergs “strenge” kriterier beskrevet af Kruger et al. (1986) på lufttørrede udstrygninger, der var fikseret i ethanol og ether og farvet med Papanicolaou-teknikken (Verdenssundhedsorganisationen, 1992). Scoring af morfologi blev foretaget af en enkelt uddannet laboratorietekniker. Sædets levedygtighed blev bestemt på eosin-negrosinfarvede udstrygninger.

Computerassisteret sædanalyse

Materiale til CASA blev fremskaffet på følgende måde: 4,5 μl friske, velblandede spermatozoer blev overført med en pipette til et Makler-tællekammer med en dybde på 10 μm. Prøven blev anbragt i et Olympus BH-2 fase-kontrastmikroskop (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Danmark) med en varmeplade (37 °C) ved ×200 forstørrelse. Et Sony-videokamera DXC-107 (Sony Corp., Tokyo, Japan) overførte billederne til en Sony PVM-1440QM farvevideomonitor (Sony Corp., Tokyo, Japan). Optagelserne af billederne blev optaget på en JVC HR-D560EG/E-videokassetteoptager (JVC Victor Company of Japan, Tokyo, Japan). Optagelserne blev senere analyseret på en Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) med en optagelsesfrekvens på 25 Hz, en sporingstid på 2 s (i alt 50 billeder) og et synsfelt på 300×300 μm (hvilket gjorde det muligt at registrere alle hastighedsværdier på op til 150 μm/s i en lige linje). Der blev analyseret 100 spermatozoer pr. prøve.

Følgende parametre blev udledt af analyserne: kurvehastighed (VCL), retliniehastighed (VSL), linearitet (LIN), gennemsnitlig banehastighed (VAP) og amplitude af lateral hovedforskydning (ALH).

Bestemmelse af zink, magnesium og calcium i sæd

Seminalzink, magnesium og calcium blev målt i alle 50 prøver. Zink- og magnesiumkoncentrationerne i sæd blev bestemt ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Instrumentet var et PQ2+ fra Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). En alikvot på 20 μl blev fortyndet 100 gange med en opløsning, der indeholdt 5 g/l 25 % ammoniak (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgien) og 0,5 g/l Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) i 18 MW Millipore-vand. Som intern standard blev scandium (AccuStandard, New Haven, CT, USA) tilsat til en slutkoncentration på 100 μg/l. Alle prøver blev fremstillet i to eksemplarer. Kalibreringen blev udført ved hjælp af blindprøver, hvortil der var tilsat zink og magnesium (AccuStandard) til slutkoncentrationer på 1, 2 og 3 mg/l, svarende til koncentrationer på 100, 200 og 300 mg/l i de oprindelige sædprøver. Denne analyse blev udført i peak jumping mode med målinger ved 24Mg, 66Zn og 45Sc.

Determination af calcium blev foretaget i de samme præparater ved hjælp af flammeatomabsorptionsspektrometri (FAAS). Instrumentet var et Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). Der blev foretaget kalibrering for koncentrationer svarende til 100, 200 og 400 mg/l i de oprindelige sædprøver. Prøver med høje calciumkoncentrationer blev fortyndet yderligere tre gange, så de faldt inden for kalibreringskurven.

Detektionsgrænserne, beregnet som tre gange standardafvigelsen for 10 blindprøver, der blev fremstillet ved samme lejlighed som prøverne, var 1 mg/l for zink, 3 mg/l for magnesium og 2 mg/l for calcium (udtrykt som koncentrationer i de ufortyndede sædprøver). De samlede variationskoefficienter i bestemmelserne, som beregnet ud fra resultaterne af dobbeltanalyserne, var 18% for zink, 32% for magnesium og 17% for calcium.

Der blev også fremstillet præparater til bestemmelse af zink ved hjælp af flammeatomabsorptionsspektrometri (FAAS) i ti af prøverne. En lineær regressionsanalyse af ICP-MS-resultaterne i forhold til FAAS-resultaterne gav en hældning på 0,79 (95 % konfidensinterval: 0,58-1,00), et intercept på 13 μg/l og r2 på 0,90. De noget højere resultater for ICP-MS-analyserne var således ikke statistisk signifikante.

Autometallografisk (AMG) udvikling af sædprøver til lysmikroskopisk analyse

Fem prøver med højt (242-308 mg/l) og 5 med lavt (38-57 mg/l) zinkindhold som bestemt ved ICP-MS blev inkuberet i 0,5% natriumsulfid (Bie & Berntsen) i 30 min. for at skabe zinksulfidgitter. Der blev lavet udstrygninger af ejakulat/sulfidopløsningen på Farmer-skyllede glasprøver. Udstrøgene blev lufttørret, fikseret i 3 % glutaraldehyd (Bie & Berntsen) i 30 min og lagt i 0,1 M fosfatbuffer i 3×2 min og en gang i destilleret vand i 2 min.

Derpå blev udstrøgene AMG-udviklet for at sølvforstærke zink-sulfidgitterne. Udviklingsmidlet bestod af 60 ml filtreret gummi arabicumopløsning (1 kg opløst i 2 l destilleret vand; Bidinger A/S, Århus, Danmark), 10 ml natriumcitratbuffer og 0,85 g hydroquinon (Merck, Darmstadt, Tyskland) opløst i 15 ml varmt, destilleret vand. Umiddelbart før brug blev der tilsat 0,11 g sølvlaktat (Fluka, Buchs, Schweiz) i 15 ml destilleret vand, og opløsningen blev blandet grundigt.

Glas, der var skyllet af en landmand, og som indeholdt sædprøverne, blev anbragt i et vandbad ved 26 °C og overført til en lystæt kasse. Den nytilberedte AMG-udvikler blev hældt i glassene, og udstrøgene blev udviklet i 30 min i den mørke kasse.

Efter udvikling blev udstrøgene skyllet i rindende deioniseret vand i 10 min, lagt i 5 % natriumthiosulfat i 5 min, vasket med rindende deioniseret vand i 2 min, efterfikseret med 70 % ethanol i 30 min og til sidst vasket med rindende deioniseret vand i 2 min. Modfarvning blev udført med en 0,1 % vandig toluidinblå opløsning, pH 4,0 (1 g toluidinblåt i 1000 ml buffer: 614,5 ml 0,1 M citronsyremonohydrat og 385,5 ml 0,2 M di-natriumhydrogenphosphatdihydrat; Merck, Darmstadt, Tyskland). Udstrøgene blev anbragt i 2 × 2 min i destilleret vand, 3 × 3 min i 99 % ethanol, 3 × 3 min i xylol og til sidst monteret med DEPEX (Merck, Darmstadt, Tyskland).

Fremstilling af sædudstrøg til elektronmikroskopisk analyse

Sædudstrøg af sædprøver blev fremstillet som beskrevet ovenfor, bortset fra at de ikke blev monteret med DEPEX. Efter proceduren blev der tilsat 0,5% osmiumtetroxid i 30 min, og udstrøgene blev anbragt i 3×2 min i buffer og 1×2 min i destilleret vand. De osmium-kontrasterede udstrygninger blev undersøgt i lysmikroskop, og områder af interesse for yderligere elektronmikroskopiske analyser blev markeret med en diamantkniv.

De udvalgte udstrygninger blev dehydreret i graduerede ethanolopløsninger og indlejret i Epon (Bie & Berntsen). Eponblokke, der blev anbragt oven på de tidligere markerede interesseområder, blev opbevaret ved 60°C i 24 timer og derefter brudt af glasudstrygningerne. Halvtynde (3 μm) snit blev skåret og anbragt på objektglas. Efter lysmikroskopiske analyser blev udvalgte sektioner genindlejret i Epon, og ultratynde sektioner blev fremstillet og kontrafarvet med blycitrat før undersøgelse i et JEOL 100S elektronmikroskop.

Statistiske metoder

Flere regressionsanalyser blev anvendt på dataene for at påvise de enkelte parametres indvirkning på resultatet. Spearmans rangkorrelationskoefficienter blev beregnet for flere korrelationer. Til sammenligning af grupper blev Wilcoxon rank-sum-testen for forskel i medianer udført.

Resultater

I tabel I er zink-, magnesium- og calciumindholdet præsenteret sammen med den relative andel af kationerne i seminalplasma. Sammenligning af medianer for disse parametre i de to grupper S-TTP versus L-TTP ved hjælp af t-test med to stikprøver afslørede ingen statistisk signifikante forskelle for nogen af disse parametre. Der blev fundet en stærk positiv interkorrelation mellem zink, magnesium og calcium (Spearmans rangkorrelationskoefficienter var 0,79-0,86, P < 0,01) (figur 1).

Ingen af kationerne var tæt korreleret med nogen af de konventionelle sædparametre. Ved udførelse af multipel regressionsanalyse på alle data var det kun zinkindholdet, der fremkom med en P-værdi under 0,05 for følgende CASA-parametre: VSL 0,04, og LIN 0,008. Indtastning af enten magnesium eller calcium i modellen forbedrede ikke værdierne.

Sædprøverne blev opdelt i to lige store grupper i henhold til kationstatus for hvert kation. Følgende opdelingspunkter (medianer for alle 50 prøver) blev identificeret: zink 112 mg/l, magnesium 98 mg/l og calcium 476 mg/l. Der blev påvist en række statistisk signifikante forskelle mellem de to grupper (tabel II). P-værdierne for zinkgrupperne viste de største forskelle, mens calciumgrupperne havde mellemliggende forskelle, og magnesiumgrupperne kun udviste ringe forskelle (undtagen for LIN).

For det relative forhold mellem kationerne (tabel III) var delingspunkterne: zink:magnesium 1,26, og zink:calcium 0,22. Prøverne med et zink:calcium-forhold på over 0,22 viste statistisk signifikant lavere værdier for CASA-parametrene VSL, LIN og STR sammenlignet med prøverne med et forhold på under 0,22. Korrelationen zink:magnesium er 0,86 (Spearmans rangkorrelationskoefficient), og for zink:calcium er den 0,79. Zinkindholdet synes at være tættere forbundet med magnesiumindholdet end calciumindholdet, hvilket kan forklare forskellen mellem grupperne.

Ved vurdering af zink-ionindholdet i AMG-præparater blev der på lysmikroskopisk niveau påvist en forskel i prøver med lavt totalzinkindhold sammenlignet med prøver med højt totalzinkindhold. Figur 2 viser forskelle i AMG-farvningen i en prøve med 299 mg/l og en prøve med 53 mg/l sædzink. Farvningen omkring akrosomet, halen og i sædplasmaet viste sig at være sparsom i prøverne med lav totalzink. Det var ikke muligt at bekræfte disse resultater på elektronmikroskopisk niveau (figur 3A), og især blev der ikke set nogen forskel i den intracellulære farvning af spermatozoerne. Figur 3B og 4 viser zinkionlokaliseringen i spermatozoernes hale. Det findes i hele halen koncentreret i de flagellære accessoriske fibre og i membranen. I det seminale plasma blev mikrometerstore legemer fundet rige på indhold af zinkioner (Figur 5).

Diskussion

Dette er så vidt vides den første undersøgelse, der evaluerer virkningen af seminalt zink, magnesium og calcium på TTP- og CASA-parametre hos raske mennesker. Der blev fundet en sammenhæng mellem høje zinkkoncentrationer og lav linearitet af sædbevægelser, som udtrykt ved et fald i VAP, VSL, STR og LIN. Magnesium- og calciumkoncentrationer var tæt korreleret med zinkkoncentrationen, men var ikke så stærkt forbundet med CASA-parametrene. Den motile koncentration viste sig at være upåvirket af den samlede koncentration af zink, magnesium og calcium. Der blev dog fundet forskelle mellem et højt versus et lavt zinkindhold og nogle CASA-parametre (tabel II). Ved sammenligning af de 25 sædprøver med den laveste samlede zinkkoncentration (median 72 mg/l) med de 25 prøver med den højeste samlede sædzinkkoncentration (median 187 mg/l) viste Wilcoxon-ranksummetesten en statistisk signifikant forskel i medianerne for VSL (P = 0,004) samt LIN (P = 0,001). For VAP var forskellen også signifikant (P = 0,02). Der blev ikke fundet nogen forskel for VCL. Da der ikke var nogen forskelle i procent motilitet eller motilitetskoncentration i prøverne med lavt og højt indhold af zink, ser det derfor ud til, at et zinkrigt miljø får sædcellerne til at bevæge sig mere tilfældigt og mindre fremadrettet. Det ser ikke ud til at reducere antallet af motile sædceller.

VSL udtrykker, hvor langt lige fremad sædcellen bevæger sig i løbet af et bestemt tidsrum, og det er højst sandsynligt, set fra et klinisk synspunkt, den vigtigste CASA-parameter. En undersøgelse af Moore og Akhondi (1996) om befrugtningskapaciteten af epididymale rottesædceller viste, at et fald i VSL var stærkt negativt korreleret med resultatet af befrugtning in vitro.

Igennem årene har der været megen debat om den rolle, som zink i seminalplasmaet spiller for sædcellernes funktioner. Sædhovedet akkumulerer en mange gange højere koncentration end sædplasmaet, og zink er afgørende for kromatinets stabilitet og kromatinets evne til at dekondensere på det rette tidspunkt (Kvist, 1982; Kvist og Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), og der er blevet foreslået en fysiologisk rolle for zink som en bevaringsmekanisme for en iboende mekanisme for hovedhalens løsrivelse (Bjorndahl og Kvist, 1982). Der har dog været modstridende rapporter om virkningen af zink i sædcellerne på sædmotiliteten, og de fleste undersøgelser har handlet om kvantitative vurderinger. I en undersøgelse af Lewis-Jones et al. (1996) fik 1178 patienter henvist til fertilitetsbehandling målt zink- og fruktosekoncentrationer i sædplasmaet, men for zink blev der ikke fundet nogen statistisk signifikant korrelation til motilitet. Abou-Shakra et al. (1989) har målt flere sporstoffer i sædplasma ved hjælp af ICP-MS, men påviste ingen korrelation mellem zinkkoncentrationen i sæden og hverken sædtæthed eller motilitet hos normosperme, oligosperme eller azoosperme mænd. Koncentrationerne af zink i deres undersøgelse svarede til de niveauer, der præsenteres i denne undersøgelse. Danscher et al. (1978) har rapporteret, at høje zinkkoncentrationer er forbundet med nedsat sædmotilitet, mens andre har rapporteret, at et højt zinkindhold i sædplasma er forbundet med en høj grad af sædcellemotilitet (Stankovic og Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

I denne undersøgelse har vi beskæftiget os både med kvantitative vurderinger af total zink og kvalitativ bestemmelse af zinkionlokalisering i sædcellen og sædvæsken. Selv om der ikke blev påvist nogen forskelle i indholdet af zinkioner i sædcellerne på ultrastrukturelt niveau (figur 2A) blandt de prøver med høj eller lav totalzink, kan de træk, der ses på lysmikroskopisk niveau (figur 1), afspejle en sammenhæng mellem den totale mængde zink og frie zinkioner i sædplasmaet. I nyere undersøgelser har Lewis-Jones et al. (1996) og Carpino et al. (1998) konkluderet, at den samlede mængde zink i sædcellerne er en upålidelig markør for spermatogen aktivitet, og de foreslår, at biotilgængelige zinkioner bundet til vesikulære proteiner med høj molekylvægt er et bedre indeks. Den AMG-metode, der præsenteres her, påviser chelaterbar zink, dvs. zinkioner i plasmaet eller zink løst bundet til makromolekyler. Zink, der er bundet fast til proteiner, vil ikke blive påvist af AMG og kan ikke chelateres. Vi er enige med de nævnte undersøgelser i, at det er den biotilgængelige (og dermed chelatérbare) zink, der udøver funktioner på sædceller, herunder motilitet. Denne undersøgelse viser, at koncentrationerne af total zink og chelaterbar zink er relateret til hinanden. Yderligere undersøgelser er nødvendige, og computerbaseret billedanalyse f.eks. af AMG-præparater kunne være et vigtigt redskab.

I modsætning til virkningerne af zink syntes en høj magnesiumkoncentration i sig selv ikke at have nogen hæmmende virkning på sædmotilitet. Der blev fundet en negativ effekt på LIN, men den var ikke stor nok til at have nogen indflydelse på de andre CASA-parametre. Det er blevet rapporteret, at humant sædplasma indeholder sekretoriske granula og vesikler af prostatisk oprindelse, som kan have en regulerende virkning på sædmotiliteten ved at modulere koncentrationen af essentielle kationer i deres omgivelser (Stegmayr et al., 1982). Membranerne i disse organeller indeholder Mg2+- og Ca2+-afhængig ATPase, der hæmmes konkurrencemæssigt af Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Der er tidligere rapporteret om en høj positiv korrelation mellem zink og magnesium i sædplasma (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), og i denne undersøgelse blev der fundet lignende stærke interkorrelationer mellem alle tre kationer (r = 0,79-0,86, P < 0,01).

Calcium er vigtigt for sædfysiologien, herunder motilitet (Morton et al, 1974; Lindemann et al., 1987), metabolisme (Peterson og Freund, 1976), akrosomreaktion og befrugtning (Yanagimachi og Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Den rolle, som sædkalcium spiller for sædmotilitet, er imidlertid ikke fuldt ud forstået. Thomas og Meizel (1988) fandt, at chelatering af ekstracellulære calciumioner med EGTA hæmmer akrosomreaktionen, men samtidig ikke har nogen virkning på motiliteten. Tilsætning af den ionofore ionomycin, der inducerer akrosomreaktion, havde heller ingen virkning på motiliteten, men øgede antallet af akrosomreagerende sædceller betydeligt. Magnus et al. (1990) fandt ingen sammenhæng mellem ioniserede calciumkoncentrationer og andelen af spermatozoer, der udviser progressiv bevægelse. Arver og Sjöberg (1982) har rapporteret, at lavt ioniseret calcium er forbundet med flere og bedre progressive bevægelige spermatozoer. Prien et al. (1990) sammenlignede sædmotilitet, hastighed og progressiv bevægelse af sædceller med total og ioniseret calcium hos patienter med normal (>60%) og nedsat (<60%) sædmotilitet. Der blev ikke fundet nogen forskel i total calcium, men der blev fundet et statistisk signifikant fald i ioniseret calcium i sædcellerne hos de mænd med nedsat motilitet. I denne undersøgelse blev total calcium målt, men den calciumbindende kapacitet i det seminale plasma kendes ikke. Som for calcium blev der ikke påvist nogen indvirkning på den motile koncentration, og korrelationerne til CASA-parametre var svagere end for zink (tabel II). Både VSL og LIN viste omvendt signifikante korrelationer til den samlede calciumkoncentration (P = 0,02 for begge), mens VCL var upåvirket. Men ved at tilføje zinkkoncentrationen i en multipel regressionsanalyse blev virkningerne af den samlede calciumkoncentration på motiliteten fjernet. Dette er i overensstemmelse med den tidligere nævnte undersøgelse af Prien et al. (1990). I denne undersøgelse udviste prøver med et lavt zink:calcium-forhold statistisk signifikant bedre CASA-værdier (VSL, LIN og STR) sammenlignet med prøver med et højt forhold. Dette skyldes hovedsagelig forskelle i zinkkoncentrationen.

Præcisionen af zink-, magnesium- og calciumbestemmelserne i denne undersøgelse var relativt ringe med variationskoefficienter på henholdsvis 18, 32 og 17 %. Årsagen er sandsynligvis inhomogenitet i prøverne, hvilket i kombination med de små prøvevolumener (20 μl) kan have forringet præcisionen. På trods af den store upræcision var den variation, der blev genereret i zink- og magnesiumbestemmelserne, mindre i forhold til det store koncentrationsinterval i prøverne.

Det er tidligere blevet påvist, at chelatering af zinkioner påvirker sædmotiliteten hos mennesker (Danscher og Rebbe, 1974), rotter og hunde (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Der gennemføres i øjeblikket undersøgelser med intra- og ekstracellulær chelatering af zinkioner, og dette kan måske afsløre betydningen af zinkionernes placering i sædvæsken og sædcellen.