Kolesterolin biosynteesireitti on pitkä, ja se vaatii huomattavia määriä pelkistävää ja ATP-energiaa, minkä vuoksi se on sisällytetty tähän. Kolesterolilla on tärkeitä tehtäviä elimistössä kalvoissa. Se on myös steroidihormonien ja sappihappojen esiaste, ja sen välitön metabolinen esiaste, 7-dehydrokolesteroli, on D-vitamiinin esiaste. Kolesteroliin johtavaa reittiä kutsutaan isoprenoidireitiksi, ja sen haarat johtavat muihin molekyyleihin, kuten muihin rasvaliukoisiin vitamiineihin.

HMG-CoA:sta HMG-CoA-entsyymi HMG-CoA-reduktaasi katalysoi mevalonaatin muodostumista. Reaktio vaatii NADPH:ta ja johtaa koentsyymi A:n vapautumiseen, ja se näyttää olevan yksi synteesireitin tärkeimmistä säätelyvaiheista. Entsyymiä säädellään sekä takaisinkytkentäinhibitiolla (kolesteroli inhiboi sitä) että kovalenttisella modifikaatiolla (fosforylaatio inhiboi sitä). Entsyymin synteesiä säädellään myös transkriptiivisesti. Kun kolesterolipitoisuus laskee, geenin transkriptio lisääntyy.

Mevalonaatti fosforyloituu kahdesti ja dekarboksyloituu sen jälkeen viiden hiilen välituotteeksi, joka tunnetaan nimellä isopentenyylipyrofosfaatti (IPP). IPP muuttuu helposti dimetyyliallylpyrofosfaatiksi (DMAPP). Nämä kaksi viiden hiilen yhdistettä, joita kutsutaan myös isopreeneiksi, ovat kolesterolin ja siihen liittyvien yhdisteiden synteesin rakennusaineita. Tätä reittiä kutsutaan isoprenoidireitiksi. Se etenee kolesterolin suuntaan alkaen IPP:n ja DMAPP:n yhdistymisestä geranyyli-pyrofosfaatiksi. Geranyyli-pyrofosfaatti yhdistyy toisen IPP:n kanssa farnesyyli-pyrofosfaatiksi, joka on 15 hiiltä sisältävä yhdiste. Kaksi farnesyyli-pyrofosfaattia yhdistyy muodostaen 30-hiilisen yhdisteen, joka tunnetaan skvaleenina. Skvaleeni muodostaa monimutkaisessa uudelleenjärjestelyssä, johon liittyy pelkistymistä ja molekulaarista happea, syklisen välituotteen, joka tunnetaan nimellä lanosteroli ja joka muistuttaa kolesterolia. Lanosterolin muuntaminen kolesteroliksi on pitkä prosessi, johon kuuluu 19 vaihetta, jotka tapahtuvat endoplasmisessa retikulumissa.

Kolesterolista voidaan muodostaa D-vitamiinia tai steroidihormoneja, joihin kuuluvat progestageenit, androgeenit, estrogeenit, mineralokortikoidit ja glukokortikoidit. Kaikkien näiden haaramolekyyli on kolesterolin metaboliitti (ja progestageeni), joka tunnetaan nimellä pregnenaloni. Progestageenit ovat kaikkien muiden luokkien esiasteita.

Estrogeenit ovat peräisin androgeeneista mielenkiintoisessa reaktiossa, joka edellyttää aromaattisen renkaan muodostumista. Tätä reaktiota katalysoiva entsyymi tunnetaan aromataasina, ja sillä on lääketieteellistä merkitystä. Estrogeenit stimuloivat joidenkin kasvainten kasvua, joten aromataasin estäjiä määrätään estämään estrogeenien muodostumista ja hidastamaan kasvainten kasvua. On syytä huomata, että myös muiden rasvaliukoisten vitamiinien ja klorofyllin synteesi haarautuu isoprenoidisynteesireitistä geranyylipyrofosfaatissa. Kahden geranyyligeranyylipyrofosfaatin yhdistyminen tapahtuu kasveissa ja bakteereissa ja johtaa lykopeenin synteesiin, joka puolestaan on A-vitamiinin lopullisen esiasteen, beetakaroteenin, esiaste. Myös E- ja K-vitamiinit sekä klorofylli syntetisoidaan geranyyligeranyylipyrofosfaatista.