Ammoniumasetaattipuskurit voivat aiheuttaa erilaisia ongelmia laboratoriossa. Kaksi yleistä ongelmaa ovat HPLC-MS:n vastapaineiden yllättävä nousu, kun laite käynnistetään yön yli kestäneen säilytyksen jälkeen, ja vaikeudet MS-herkkyyden kanssa.
Laitteen vastapaineiden nousu ammoniumasetaattia (ja ammoniumformiaattia) käytettäessä on yleinen ongelma, jota on havaittu kromatografiafoorumeilla, erityisesti silloin, kun laite oli seissyt yön yli tai päivän ensimmäisten ajojen aikana. Korkealiukoiset vesipuskurit voivat aiheuttaa paljon pään raapimista. Niistä tulee käytännön käytössä ongelmallisia, sillä ne tukkivat kapillaareja, esikolonneja ja analyyttisten kolonnien päätefriittejä.
Nämä ongelmat johtuvat poikkeuksetta siitä, että puskurien liukoisuutta sekoitettuihin orgaanisiin vesiympäristöihin on ymmärretty väärin. Tästä voidaan päästä eroon kuvassa 1 esitettyjen tietojen avulla.
Kuva 1: Viiden puskurin liukoisuus seoksissa asetonitriilin kanssa. (Mukailtu luvalla lähteestä Ref. 1)
Kuvasta 1 nähdään selvästi, että ammoniumasetaatin liukoisuus yli 90 % asetonitriiliä sisältävissä binääriseoksissa on yhä rajoitetummin liukeneva ja täysin liukenematon 100 %:n asetonitriiliin. Kun 20 mM ammoniumasetaattia on liukoisuusraja 90-prosenttisessa asetonitriilissä, tämä raja laskee jyrkästi 10 mM ammoniumasetaattiin (suosittu LC-MS-sovelluksissa käytetty puskurikonsentraatio) 95-prosenttisessa asetonitriiliseoksessa. Näiden liukoisuusrajojen ylittäminen johtaa sameaan nesteeseen, koska liuoksessa on hienojakoista ammoniumasetaattisakkaa. Tämä voi tukkia kapillaarit ja kolonnin fritsit aiheuttaen järjestelmän vastapaineen kasvua. On myös huomattava, että kuvan 1 tiedot on saatu käyttämällä korkealaatuista puskuria – liukoisuus heikkenee, jos käytetään heikompilaatuisia (puhtaampia) puskurisuolareagensseja. Vältä liuottamasta ammoniumasetaattia puhtaaseen asetonitriiliin, vaikka liuokseen voidaankin lisätä vettä. Vaikka aluksi saattaa näyttää siltä, että puskuri on liukoinen, se tippuu nopeasti pois liuoksesta (kuva 2).
Kuva 2: Ammoniumasetaattijäämä, joka syntyy, kun ammoniumasetaattia “liuotetaan” asetonitriiliin ja sen jälkeen lisätään vettä, jotta saavutetaan tarvittava orgaanisen/vesipitoisen eluentin suhde (Valokuva, jonka on suonut Dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Iso-Britannia).
Tyypillisessä käänteisfaasi-HPLC-gradientissa tämä ei ehkä ole niin suuri ongelma, ellei gradientti tietenkään mene >90 %:iin asetonitriiliä. On kuitenkin muitakin näkökohtia, kuten orgaanisen liuottimen suhteelliset prosenttiosuudet, joita vesipuskuri voi kohdata sekoitettaessa matala- tai korkeapaineisia sekoitusjärjestelmiä käyttäen, ruiskutettaessa näytteitä, jotka on liuotettu korkeisiin prosentteihin asetonitriiliä, tai pahimmassa tapauksessa, kun järjestelmiä huuhdellaan 100-prosenttisella asetonitriilillä kolonnin epäpuhtauksien poistamiseksi tai yön yli tapahtuvaa varastointia varten.
Käytettäessä 100-prosenttista asetonitriiliä kolonnin säilytykseen on lisäksi otettava huomioon, että 100-prosenttisessa orgaanisessa liuottimessa voi tapahtua suuria pH:n siirtymiä, ja on otettava huomioon, että nämä pH:n siirtymät saattavat viedä kolonnin säilytyksen pH:n alueelle, jossa piioksidimatriisin liukeneminen voi olla mahdollista, mikä johtaa “hienoaineksen” muodostumiseen kolonnissa, mikä lopulta johtaa kolonnin tukkeutumiseen (korkeassa pH:ssa) tai sidoksissa olevien faasiligandien poistumiseen (alhaisessa pH:ssa).
Ammoniumasetaatti puskurina
Moni on valinnut puskurina ammoniumasetaatin, erityisesti käytettäessä MS-tunnistusta, koska se on luonnostaan haihtuva ja sillä on pieni taipumus API-lähdekontaminaatioon. On kuitenkin otettava huomioon tämä rajallinen liukoisuus ja mukautettava HPLC-käytäntömme sen mukaisesti. Ymmärrä, onko ammoniumasetaatin käyttö tarkoituksenmukaista kokeessa ja onko puskuri todella tarpeen. Puskurin käyttöä koskevat vaatimukset sekä puskurin asianmukainen valinta ja konsentraatio ymmärretään usein väärin. Ammoniumasetaatti on tapaus, jonka avulla voidaan tutkia tämän paljon rakastetun puskurijärjestelmän käyttöä ja väärinkäyttöä.
Puskureita tarvitaan vastustamaan pieniä muutoksia pH:ssa (lähinnä eluentin pH:ssa) ja varmistamaan, että HPLC-kolonni pysyy vakiovarauksen tilassa (lähinnä silika-tuen pinnalle jäävien silanolilajien ionisoitumistilassa). pH:n muutokset voivat aiheuttaa ongelmia retentioajan pysyvyydessä, piikin muodossa ja (käytettäessä Electrospray MS:ää) laitteen herkkyydessä. Tyypillisesti suurin “haaste” järjestelmän pH:lle aiheutuu näytteen laimennusaineen ja eluentin sekoittumisesta injektorin ja HPLC-kolonnin (tai esikolonnin) välisissä liitososissa ja kolonnin päässä. Jos näytelaimennusaineella on erilainen pH, analyytti (tai osa analyytin molekyyleistä) saattaa muuttaa ionisaatiotilaa ja kromatografoitua eri tavalla tai reagoida eri tavalla MS-rajapinnassa. Analyysimenetelmämme kemian ymmärtäminen on kuitenkin tärkeää, jotta voimme tehdä kriittisiä valintoja puskurin tyypin ja konsentraation suhteen. pH:n säätöä vaativat analyyttipitoisuudet ja kolonnin pinnan määrä ovat niin alhaisia, että tarvitaan vain hyvin pieni puskurikonsentraatio toistettavien retentioaikojen, hyväksyttävän piikin muodon ja detektioherkkyyden ylläpitämiseksi.
Kuvassa 3 on esitetty tilanteet, joissa ammoniumasetaatista voi olla hyötyä sekä kromatografiassa että massaspektrometriassa.
Kuva 3: Puskurikapasiteetin vaihtelu vesipitoisen ammoniumasetaattiliuoksen (10 mM) puskurikapasiteetin vaihtelu eri osuuksilla asetonitriiliä (%) (Mukailtu luvalla lähteestä Ref. 2)
Välttämättä on kaksi puskurointialuetta, kun 10 mM ammoniumasetaattia lisätään eluenttiliuokseen ja pH:n säätämiseen käytetään joko laimeaa ammoniakkia tai muurahaishappoa. Ilman hapon tai emäksen lisäämistä liuoksella on hyvin vähän puskurikapasiteettia.
100-prosenttisessa vesiliuoksessa puskurin pKa-arvot ovat noin 4,8 ja 9,5. Puskuria käytetään parhaiten noin +/- 1 pH-yksikön päässä puskurin pKa:sta, jolloin puskurikapasiteetti vähenee noin 66 %:iin. 2 pH-yksikön päässä puskurin pKa:sta puskurikapasiteetti pienenee noin 5 %:iin. Kun kyseessä on ammoniumasetaattipuskuri vedessä, erotukseen käytettävän eluentin pH:n tulisi olla 3,8-5,8, kun pH:n muurahaishappoa käytetään pH:n muokkaajana, ja 8,5-10,5, kun eluentin pH:n säätämiseen käytetään ammoniakkia. Varoitus: kun järjestelmään lisätään asetonitriiliä, tämä työalue muuttuu ja käyttökelpoiseksi pH-alueeksi tulee 5,2-7,2 tai 7,9-9,9, kun asetonitriiliä on 60 %. Gradienttierotuksissa puskurijärjestelmän pKa muuttuu jatkuvasti. Järjestelmän pKa:ta gradientin lähtökoostumuksessa käytetään arvioimaan puskurin käyttökelpoisuutta erotuksessa.
Ovatko nämä pH-alueet riittäviä, jotta vältetään muutokset analyytin ionisaation laajuudessa tai kolonnin protonoitumisen muutokset? Tämä on avainkysymys.
MS-detektointia varten ionogeeniset analyytit ionisoidussa muodossa johtavat hyvään detektioherkkyyteen, kun taas käänteisfaasiretentio hallitaan stationäärifaasin ja orgaanisen liuottimen tyypin ja koostumuksen harkitun valinnan avulla. Jos analyytti ionisoituu täysin edellä (ja kuvassa 3) ehdotetuilla pH-alueilla, tuloksena on hyvä kromatografinen ja detektiokyky. Huomaa kuvasta 1, että järjestelmän puskurikapasiteetti pienenee asetonitriiliä lisättäessä, ja puskurikapasiteetti laskee 30 prosenttiin vesipitoisesta arvosta 60 prosentin asetonitriilipitoisuudella. Keskeinen periaate puskurin käytössä LC-MS:ssä on käyttää mahdollisimman vähän, jotta retentioaikojen toistettavuus, hyväksyttävä piikin muoto ja detektorin herkkyys säilyvät. Puskurikonsentraatio vaikuttaa suoraan ionisuppression määrään ja siten suoraan menetelmän herkkyyteen. Hyvän puskurikapasiteetin säilyttämiseksi pienemmillä puskurikonsentraatioilla pyrimme usein työskentelemään +/- 0,5 yksikön sisällä puskurin pKa:sta.
Taulukossa 1 esitetään suositellut pH-alueet, joilla ammoniumasetaattipuskurit ovat hyödyllisiä.
| % MeCN | Maksimipuskurikapasiteettialue (etikkahappo / asetaatti) | Maksimipuskurikapasiteettialue (ammonium / ammoniakki) | Puskurikapasiteettialue (% suhteutettuna 100 %:n Aq-liuokseen) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
Taulukkoa 1: Suositellut pH-työalueet ja ohjeelliset suhteelliset puskurointikapasiteetit 0,1 mM ammoniumasetaatti (aq) / asetonitriilieluenttijärjestelmille.
Valitaan taulukon 1 puskurointialueiden avulla eluentin pH-arvo, jossa analyytin pitäisi ionisoitua 100-prosenttisesti. Huomaa, että näiden lukujen johtamisessa käytetty puskurikonsentraatio on 0,1 mM – suosittu valinta puskurikonsentraatioksi, kun käytetään MS-detektiota. Emäksisten analyyttien osalta etikkahappo/asetaatti-puskurijärjestelmä on yleinen, ja eluentin pH on yleensä selvästi alle emäksisten analyyttien pKa:n, mikä varmistaa, että ne protonoituvat jatkuvasti. Sama voi päteä happamien analyyttien kohdalla ammonium/ammoniakki-järjestelmällä, jossa happamien analyyttien pitäisi olla täysin deprotonoituja. Näin varmistetaan, että retentioajat ovat tasaisia, piikkien muodot ovat terveitä ja että MS-herkkyys on optimoitu menetelmäkemian näkökulmasta.
Ammoniumasetaattipohjaisten eluenttien tehokkaissa puskurointialueissa on suuria aukkoja. Toisin sanoen 20-prosenttisen asetronitriilieluentin koostumuksella (tai 20-prosenttisen asetonitriilin lähtögradientin koostumuksella) puskurikapasiteetti on todennäköisesti alhaisempi (on käytettävä suurempia puskurikonsentraatioita) eluentin pH:n ollessa alle 4,2, pH:n 5,2 ja 9,0 välillä tai yli 10,0. On olemassa muita menetelmiä, joissa eluentin pH säädetään näiden suositeltujen alueiden ulkopuolelle, kun käytetään ammoniumasetaattipuskureita. Harkitse toisen puskurijärjestelmän käyttöä – formaatti/muurahaishappojärjestelmä on suosittu valinta eluentin pH-arvojen ollessa alle 4,2.
Pitäisikö puskuria aina käyttää?
Jos eluentin pH on kaukana analyytin pKa:sta, pienillä muutoksilla eluentin pH:ssa on vähäinen vaikutus analyytin ionisoitumisasteeseen. Näissä olosuhteissa puskurin käyttö voi olla tarpeetonta. Esimerkiksi etikkahapolla (samoin kuin muurahais-, tri- ja difluorietikkahapolla) on huomattava “itsepuskurointikapasiteetti” matalassa pH:ssa, ja se antaa emäksisen analyytin pKa:n >2 pH-yksikköä korkeammaksi ja happaman analyytin pKa:n
Tässä oletetaan, että emäksiset analyytit analysoidaan happamalla eluenttisysteemillä ja happamat analyytit emäksisemmällä eluenttisysteemillä pH:lla täydellisen ionisoitumisen ja hyvän sähkösuihkutus-MS:n herkkyyden varmistamiseksi. Jos ilmenee ongelmia laitteen vastapaineen, retentioaikojen epävakauden tai MS-ilmaisun herkkyyden kanssa, voi olla syytä harkita, tarvitaanko puskurisuolaa lainkaan. Muurahais- tai etikkahapon tai ammoniakkiliuoksen harkittu käyttö voi hyvinkin ratkaista ongelmat.
Tapauksesta riippumatta on syytä käyttää aikaa menetelmän kemian ymmärtämiseen analyytin pKa:n, vaaditun eluentin pH:n ja puskurijärjestelmän valinnan kannalta, jota käytetään tämän pH:n saavuttamiseksi ja ylläpitämiseksi järjestelmässä.
Niille, joilla ei ole analyytin pKa:ta koskevia tietoja, on saatavana useita ilmaisia ohjelmia, jotka pystyvät kohtuulliseen työhön analyytin pKa:n ennakoimiseksi rakenteensa perusteella. Laboratorioissamme laajalti käytettyjä ovat:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Jos kaipaat syvällisempää ymmärrystä puskureista ja niiden käytöstä HPLC:ssä ja LC-MS:ssä, tutustu artikkeleihin viitteissä 3-6.
Solubility of Buffers in Aqueous-Organic Eluents for Reversed-Phase Liquid Chromatography, Adam P. Schellinger ja Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch ja Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobiilifaasipuskurit, osa I – pH:n tulkinta osittain vesipitoisissa liikkuvissa faaseissa, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
Mobile Phase Buffers in LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Number 7, July 2019