Tämän menettelyn yleistavoitteena on uuttaa peräkkäin RNA:ta ja DNA:ta arkistoiduista formaliiniin kiinnitetyistä parafiiniin upotetuista kudosydämistä. Tässä protokollassa kerätään kudosydämiä, joista uutetaan sekä RNA:ta että DNA:ta. Tämän protokollan tärkein etu on, että se parantaa RNA:n ja DNA:n saantoa tarkasti kohdennetuilta alueilta kudoslohkossa.

Tämä menettely on pitkälti kehitetty arkistoiduissa eturauhassyöpäkudoksissa. Sitä voidaan soveltaa myös muuntyyppisiin arkistoituihin kudoksiin. Tämän menetelmän visuaalinen havainnollistaminen on kriittisen tärkeää, koska kudoslohkon poimintavaiheita ei yleisesti käytetä tutkimuslaboratorioissa.

Useimmat tutkimuslaboratoriot käyttävät sen sijaan poikkileikkauksia, jotka kuluttavat kudokset nopeammin ja lisäävät näytteeseen merkittävää heterogeenisuutta. Aloita tarkastelemalla mikroskooppidiaa ja hahmottelemalla kiinnostuksen kohteena oleva alue hienokärkisellä permanenttimerkillä. Seuraavaksi leikataan parafiinikalvosta riittävän suuri osa, jotta se peittää kiinnostuksen kohteena olevan alueen mikroskooppidiaan.

Asetetaan sitten kalvo tukevasti objektilasille ja kääritään kalvo reunojen yli, jotta se ei pääse liukumaan. Hienokärkisellä pysyvällä tussilla hahmotellaan koko kudos ja kiinnostuksen kohteena oleva alue kudoksen sisällä. Poista seuraavaksi kalvo objektilasilta ja siirrä se vastaavaan kudoslohkoon.

Kohdista kalvo kääntämällä tai kiertämällä sitä niin, että koko kudoksen ääriviivat vastaavat lohkossa olevan kudoksen havaittua muotoa. Paina kalvon osa tiukasti kiinni lohkon pintaan liukumisen estämiseksi. Tee pysyvän tussin kärjellä matalia mutta näkyviä painaumia kiinnostuksen kohteena olevan alueen ääriviivoihin ja poista sitten kalvo.

Puhdista seuraavaksi 0,6 millimetrin rei’ityssarjan reseptorirei’itys upottamalla kärki 1,5 millilitran mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää yhden millilitran valkaisuainetta, ja liu’uttamalla rei’itystä useita kertoja ylös ja alas. Toista pesu 70-prosenttista etanolia sisältävällä putkella ja sitten vedellä. Paina nyt puhdistettu rei’itys halutulle alueelle kolmen millimetrin syvyyteen ja vedä takaisin.

Vapauta ydin vähän sitovaan mikrosentrifugiputkeen työntämällä se ulos rei’ityksestä kynällä. Lisätään yksi millilitra ksyleeniä kudosydämiä sisältäviin mikrofuugiputkiin ja vorteksoidaan voimakkaasti kymmenen sekunnin ajan. Aseta sitten lämpöblokkiin, joka on asetettu 50 celsiusasteeseen kolmeksi minuutiksi.

Inkuboinnin jälkeen sentrifugoi kahden minuutin ajan huoneenlämmössä suurimmalla nopeudella. Sentrifugoinnin jälkeen ydinkappaleet asetetaan jäähän viideksi minuutiksi vahamaisen jäännöksen jähmettymiseksi. Poista nyt varovasti pipetin kärjellä parafiini, joka on kertynyt meniskin ympärille yhdessä supernatantin kanssa.

Toista sitten ksyleenikäsittely. Kun parafiini-ksyleeniseos on poistettu, lisätään yksi millilitra 100-prosenttista etanolia ja vorteksoidaan voimakkaasti kymmenen sekunnin ajan. Kun olet sentrifugoinut suurimmalla nopeudella kaksi minuuttia, hävitä etanoli varovasti.

Toista etanolipesu vielä kerran ennen homogenisoinnin aloittamista. Resuspendoi deparafinoidut ytimet 700 mikrolitraan 100-prosenttista etanolia ennen homogenointia. Käytä moottoroitua kudoshomogenisaattoria keskipitkällä asetuksella ytimien jauhamiseksi hienoiksi hiukkasiksi.

Kudosytimien perusteellinen homogenisointi on tarpeen optimaalisen DNA- ja RNA-tuoton saamiseksi. Seuraavaksi täytetään erilliset 15 millilitran putket noin kymmenellä millilitralla valkaisuainetta, RNaasin neutralointiliuosta ja 70-prosenttista etanolia. Näytteen homogenisoinnin jälkeen pese homogenisaattorin anturi kussakin puhdistusliuoksessa järjestyksessä.

Käynnistä homogenisaattori suurimmalla nopeudella pesuvaiheen aikana. Pyyhi anturi nenäliinalla ja anna anturin kuivua kokonaan ennen seuraavan näytteen homogenointia. Tarkasta anturin terät silmämääräisesti jäljellä olevien kudospalojen varalta, ja jos niitä löytyy, puhdista anturi uudelleen.

Homogenisoinnin jälkeen nosta näytetilavuus yhteen millilitraan 100-prosenttisella etanolilla ja sentrifugoi sitten suurimmalla nopeudella 15 minuutin ajan. Imeytä etanoli varovasti ja kuivaa pelletit ilmakuiviksi noin 15-20 minuutin ajan ennen kuin aloitat proteinaasi K -uuton. Resuspendoi pelletit 150 mikrolitraan proteinaasi K -digestiopuskuria ja heiluta putkia pelletin irrottamiseksi.

Yön yli tapahtuvaa proteinaasi K -digestiota suositellaan DNA:n suuremman talteenoton saavuttamiseksi. Lisätään 10 mikrolitraa lämpötilaltaan stabiilia proteinaasi K:ta ja sekoitetaan nykäisemällä. Inkuboidaan 56 celsiusasteessa 15 minuuttia lievästi sekoittaen.

Inkuboidaan putkia jäällä kolme minuuttia. Jäähdytyksen jälkeen sentrifugoi putkea 15 minuuttia suurimmalla nopeudella. Siirrä seuraavaksi kukin supernatantti varovasti uuteen mikrosentrifugiputkeen RNA:n puhdistusta varten häiritsemättä pellettejä.

Extraktoi RNA ja DNA käyttämällä kirjallisessa pöytäkirjassa esitettyä optimoitua menettelyä, joka sisältää pidennetyn kudosdigestioajan DNA:n uuttamista varten. RNA:ta ja DNA:ta voidaan ottaa talteen vanhemmista formaliinifiksoiduista parafiiniin upotetuista kudosnäytteistä tällä menetelmällä. Nukleiinihappoja uutettiin yhdessä eturauhassyöpänäytteistä, joiden näytteen ikä vaihteli kolmesta 14 vuoteen.

Keskimääräinen saanto oli 2 270 nanogrammaa RNA:ta ja 820 nanogrammaa DNA:ta. Mielenkiintoista oli, että kudosnäytteen iän ja nukleiinihappojen talteenoton välillä ei ollut merkittävää korrelaatiota. Kaiken kaikkiaan RNA:n ja DNA:n saannot korreloivat eri näytteissä, vaikka useimmissa tapauksissa RNA:ta saatiin talteen yli kaksi kertaa enemmän kuin DNA:ta.

Tämän protokollan avulla uutetun genomisen DNA:n suorituskyvyn osoittamiseksi arkistoitujen eturauhassyöpänäytteiden bisulfiittimuunnetut DNA-uutteet monistettiin metylaatiospesifisellä PCR:llä. Metylaatiokontrollina käytettiin ALU:n toistuvia elementtejä, jotka osoittivat vain vähän vaihtelua näytteiden välillä. GSTP1-geeni, jonka tiedetään olevan hypermetyloitunut eturauhassyövässä, ei osoittanut havaittavaa monistumista metylaatiospesifisellä PCR:llä, kun käytettiin hyvänlaatuisista näytteistä uutettua DNA:ta.

Agressiivista eturauhassyöpää sairastavien potilaiden DNA-näytteissä havaittiin QPCR-syklin kynnysarvoja, jotka olivat alhaisemmat kuin indolentteihin eturauhassyöpäsoluihin perustuvissa DNA-näytteissä, mikä osoittaa, että eturauhassyöpään sairastuneiden potilaiden kohdalla on lisääntynyt eturauhassyöpään kohdistuva metylaatio (GSTP1). Kun tämä tekniikka on hallussa, se voidaan tehdä kolmessa tai neljässä tunnissa RNA:n osalta ja yön yli tapahtuvan digestion jälkeen neljässä tunnissa DNA:n osalta, jos se tehdään oikein. Tämän tekniikan avulla molekyylipatologian tutkijoiden pitäisi pystyä tutkimaan diagnostisia DNA- ja RNA-biomarkkereita erilaisissa syövissä.

Katsottuasi tämän videon sinulla pitäisi olla hyvä käsitys siitä, miten kudosydämiä valmistellaan DNA:n ja RNA:n uuttamiseksi tarkasti kartoitetuilta kiinnostuksen kohteena olevilta alueilta arkistoitavista kudosblokeista.