ImmunohistokemiaEdit
Immunohistokemia eli kudosleikkeiden IHC-värjäys (tai immunosytokemia, joka tarkoittaa solujen värjäystä), on ehkä yleisimmin käytetty immunovärjäystekniikka. Ensimmäisissä IHC-värjäyksissä käytettiin fluoresoivia väriaineita (ks. immunofluoresenssi), mutta nykyään käytetään myös muita ei-fluoresoivia menetelmiä, joissa käytetään entsyymejä, kuten peroksidaasia (ks. immunoperoksidaasivärjäys) ja alkalista fosfataasia. Nämä entsyymit pystyvät katalysoimaan reaktioita, jotka tuottavat värillisen tuotteen, joka on helposti havaittavissa valomikroskopialla. Vaihtoehtoisesti merkkeinä voidaan käyttää radioaktiivisia elementtejä, ja immunoreaktio voidaan visualisoida autoradiografialla.
Kudoksen valmistelu tai fiksaatio on olennaista solujen morfologian ja kudosarkkitehtuurin säilymisen kannalta. Epäasianmukainen tai pitkäaikainen fiksaatio voi heikentää vasta-aineen sitoutumiskykyä merkittävästi. Monet antigeenit voidaan menestyksekkäästi osoittaa formaliinilla fiksoiduista parafiiniin upotetuista kudosleikkeistä. Jotkin antigeenit eivät kuitenkaan kestä edes kohtalaista aldehydifiksaatiota. Näissä olosuhteissa kudokset olisi pakastettava nopeasti nestemäisessä typessä ja leikattava kryostaatilla. Jäädytettyjen leikkeiden haittapuolia ovat huono morfologia, heikko resoluutio suuremmilla suurennoksilla, vaikeus leikata parafiinileikkeitä ja pakastesäilytyksen tarve. Vaihtoehtoisesti vibratomileikkaukset eivät edellytä kudoksen käsittelyä orgaanisilla liuottimilla tai korkealla lämmöllä, jotka voivat tuhota antigeenisyyden, tai kudoksen häiritsemistä pakastamalla sulattamalla. Vibratomileikkausten haittapuolena on se, että leikkausprosessi on hidas ja hankala pehmeissä ja huonosti kiinnittyneissä kudoksissa ja että leikkeissä on usein havaittavissa kolhiintumisjälkiä tai vibratomiviivoja.
Monien antigeenien havaitsemista voidaan parantaa huomattavasti antigeenin talteenottomenetelmillä, jotka toimivat rikkomalla joitakin kiinnittämisen yhteydessä muodostuneita proteiinien ristisidoksia ja paljastavat piilossa olevat antigeenikohdat. Tämä voidaan toteuttaa kuumentamalla eri pituisia aikoja (heat induced epitope retrieval eli HIER) tai käyttämällä entsyymidigestiota (proteolytic induced epitope retrieval eli PIER).
Yksi IHC-värjäyksen suurimmista vaikeuksista on spesifisen tai epäspesifisen taustan voittaminen. Fiksaatiomenetelmien ja -aikojen optimointi, esikäsittely estoaineilla, vasta-aineiden inkubointi korkeassa suolassa sekä vasta-aineiden jälkeisten pesupuskurien ja pesuaikojen optimointi ovat kaikki tärkeitä laadukkaan immunovärjäyksen saamiseksi. Lisäksi positiivisten ja negatiivisten kontrollien olemassaolo värjäystä varten on olennaisen tärkeää spesifisyyden määrittämiseksi.
VirtaussytometriaMuokkaa
Virtaussytometriä voidaan käyttää yhtä tai useampaa spesifistä proteiinia ilmentävien solujen suoraan analysointiin. Solut immunovärjätään liuoksessa käyttäen samankaltaisia menetelmiä kuin immunofluoresenssissa, minkä jälkeen ne analysoidaan virtaussytometrialla.
Virtaussytometrialla on useita etuja IHC:hen verrattuna, muun muassa seuraavat: kyky määritellä erillisiä solupopulaatioita niiden koon ja rakeisuuden perusteella, kyky sulkea kuolleet solut pois, parempi herkkyys ja monivärianalyysi, jolla voidaan mitata useita antigeenejä samanaikaisesti. Virtaussytometria voi kuitenkin olla tehottomampi erittäin harvinaisten solupopulaatioiden havaitsemisessa, ja arkkitehtoniset suhteet häviävät kudosleikkauksen puuttuessa. Virtaussytometriaan liittyy myös korkeat pääomakustannukset, jotka liittyvät virtaussytometrin hankintaan.
Western blotting Muokkaa
Western blotting mahdollistaa spesifisten proteiinien osoittamisen soluista tai kudoksista tehdyistä uutteista ennen puhdistusvaiheita tai niiden jälkeen. Proteiinit erotetaan yleensä koon mukaan geelielektroforeesilla ennen kuin ne siirretään synteettiselle kalvolle kuivalla, puolikuivalla tai märällä blotting-menetelmällä. Tämän jälkeen kalvo voidaan tutkia vasta-aineilla käyttäen immunohistokemian kaltaisia menetelmiä, mutta ilman kiinnittämistä. Detektointi suoritetaan tyypillisesti käyttämällä peroksidaasiin sidottuja vasta-aineita kemiluminesenssireaktion katalysoimiseksi.
Western blotting on rutiininomainen molekyylibiologinen menetelmä, jota voidaan käyttää proteiinipitoisuuksien puolikvantitatiiviseen vertailuun uutteiden välillä. Blottia edeltävä kokoerotus mahdollistaa proteiinin molekyylipainon mittaamisen verrattuna tunnettuihin molekyylipainomarkkereihin.
Enzyme-linked immunosorbent assay Muokkaa
Enzyme-linked immunosorbent assay eli ELISA on diagnostinen menetelmä proteiinipitoisuuksien määritykseen kvantitatiivisesti tai semi-kvantitatiivisesti veriplasmasta, seerumista tai solu-/kudosuutteista monikuoppalevymuodossa (yleensä 96 kuoppaa levyä kohti). Yleisesti ottaen liuoksessa olevat proteiinit adsorboituvat ELISA-levyille. Kiinnostavalle proteiinille spesifisiä vasta-aineita käytetään näytteenottoon levyllä. Tausta minimoidaan optimoimalla esto- ja pesumenetelmät (kuten IHC:ssä), ja spesifisyys varmistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien avulla. Detektiomenetelmät ovat yleensä kolorimetrisiä tai kemiluminesenssiin perustuvia.
Immuno-elektronimikroskopia Muokkaa
Elektronimikroskopian eli EM:n avulla voidaan tutkia kudosten tai solujen yksityiskohtaista mikroarkkitehtuuria. Immuno-EM mahdollistaa spesifisten proteiinien havaitsemisen ultraohutista kudosleikkeistä. Raskasmetallihiukkasilla (esim. kulta) leimatut vasta-aineet voidaan visualisoida suoraan läpäisyelektronimikroskopialla. Vaikka immuno-EM on tehokas proteiinin solunsisäisen lokalisoitumisen havaitsemisessa, se voi olla teknisesti haastava ja kallis ja edellyttää kudosten kiinnitys- ja käsittelymenetelmien tarkkaa optimointia. Proteiinien biotinylointia in vivo ehdotettiin lievittämään ongelmia, jotka johtuvat vasta-ainevärjäyksen ja solujen morfologiaa paremmin säilyttävien fiksaatioprotokollien välisestä usein esiintyvästä yhteensopimattomuudesta.