Luokan harjoitustyö

Mittakaa aika, joka amylaasilla kuluu tärkkelyksen täydelliseen pilkkomiseen, ottamalla näytteitä 10 sekunnin välein ja merkitsemällä muistiin aika, jolloin liuos ei enää anna jodiliuoksella sinimustaa väriä (mutta jodiliuos pysyy oranssina). Käytä puskureita eri pH-arvoilla olevien liuosten tuottamiseksi. Laske tämän entsyymin ohjaaman reaktion nopeus laskemalla 1÷ aika.

Tunnin järjestäminen

Tämä toimenpide on tarpeeksi yksinkertainen yksilöiden suoritettavaksi, jos sinulla on riittävästi kuoppalaattoja. Jos päätät tutkia viittä pH-arvoa, viiden oppilaan ryhmät voivat suorittaa tutkimuksen työskentelemällä yhdessä ja yhdistämällä tulokset.

Välineet ja kemikaalit

Terveydenhuolto & Turvallisuus- ja teknisiä huomautuksia

Amylaasiliuoksen ja jodiliuoksen vaara on vähäinen sen jälkeen, kun liuos on valmistettu. Käytä silmiensuojaimia jodiliuosta käsiteltäessä.
Puskurien vaarallisuus voi vaihdella. Katso CLEAPSS:n reseptikortti tai toimittajan tiedot ja katso huomautus 3.

1 Amylaasi (Katso CLEAPSS:n vaarakortti ja reseptikortti) Jauhemainen entsyymi on VAARALLINEN, mutta alle 1 %:n liuokset ovat MATALAN VAARALLISIA. On viisasta testata hyvissä ajoin etukäteen varastoidun entsyymin aktiivisuus sen tavanomaisella käyttökonsentraatiolla, jotta voidaan tarkistaa, että substraatit hajoavat sopivalla nopeudella. Entsyymit voivat hajota varastoinnin aikana, ja tämä antaa aikaa konsentraatioiden säätämiseen tai tuoreiden varastojen hankkimiseen. Amylaasi menettää hitaasti aktiivisuuttaan, joten jokaista oppituntia varten on parasta valmistaa uusi erä; erien aktiivisuus voi vaihdella, eivätkä eri päivinä kerätyt tulokset ole vertailukelpoisia. Entsyymin optimaalinen lämpötila on lueteltu toimittajan etiketissä.

Syljen käyttö: CLEAPSS-laboratoriokäsikirjassa annetaan ohjeita varotoimenpiteistä (mukaan lukien hygieniavarotoimet), joita on noudatettava, jotta sylkeä voidaan käyttää turvallisesti amylaasin lähteenä. Tämän etuna on se, että se on halvempaa, eikä teknikkojen tarvitse valmistaa uusia liuoksia joka oppitunnilla, se kiinnostaa suoraan oppilaita ja sylkiamylaasi on luotettava. Se tarjoaa myös tilaisuuden opettaa hyviä hygieniavarotoimia – mukaan lukien sen varmistaminen, että oppilaat käyttävät vain omia sylkinäytteitään (tarjotkaa pieniä dekantterilaseja, joihin sylkeä voi sylkeä), että oppilaat ovat vastuussa omien välineidensä huuhtelusta ja että kaikki saastuneet lasitavarat asetetaan kulhoon tai ämpäriin, jossa on natriumkloraattia(I), ennen kuin teknikot peseytyvät.

2 Tärkkelyssuspensio – valmistetaan tuoreena. Valmistetaan kerma 5 g:sta liukoista tärkkelystä kylmään veteen. Kaada 500 cm3 kiehuvaan veteen ja sekoita hyvin. Keitä, kunnes saat kirkkaan liuoksen. Älä käytä muunnettua tärkkelystä.

3 Puskurit: (Katso CLEAPSS-reseptikortti) Jos valmistat yleispuskuria, se sisältää natriumhydroksidia noin 0,25 M, ja siinä on oltava merkintä IRRITANT. Katso muita asiaankuuluvia vaarakortteja, jos päätät valmistaa muita puskureita, tai toimittajan tietoja, jos ostat puskuriliuoksia/tabletteja. (Huomautus 1)

4 Jodiliuos (Katso CLEAPSS Hazcard ja Reseptikortti). Tärkkelystestaukseen soveltuu 0,01 M:n liuos. Valmistetaan 10-kertaisella laimennoksella 0,1 M liuoksesta. Valmistettuna liuos on vähäinen vaara, mutta saattaa läikkyessään värjätä ihoa tai vaatteita.

Eettiset kysymykset

Tähän menettelyyn ei liity eettisiä kysymyksiä.

Menetelmä

TURVALLISUUS: Kaikki tehdyt ratkaisut ovat vaarattomia. Käytä silmäsuojaimia, sillä jodi voi ärsyttää silmiä.

Valmistelu

a Tarkista reaktion nopeus ehdotetuilla käytettävien reaktanttien määrillä – 2 cm3 tärkkelystä: 2 cm3 amylaasia: 1 cm3 puskuria pH:ssa 6. Ihannetapauksessa reaktion pitäisi kestää noin 60 sekuntia tässä pH:ssa: tämä on amylaasin tavanomainen optimiarvo (ks. huomautus 1). Jos reaktio on liian nopea, joko pienennetään entsyymin määrää tai lisätään tärkkelyksen määrää. Jos reaktio on liian hidas, lisää entsyymin tilavuutta tai konsentraatiota tai vähennä tärkkelyksen tilavuutta tai konsentraatiota.

Tutkimus

b Asettele yksittäisiä pisaroita jodiliuosta riveihin laatan päälle.

c Merkitse koeputkeen testattava ph.

d Laita ruiskulla 2 cm3 amylaasia koeputkeen.

e Lisää ruiskulla 1 cm3 puskuriliuosta koeputkeen.

f Lisää toisella ruiskulla 2 cm3 tärkkelystä amylaasi/puskuriliuokseen, käynnistä pysäytyskello ja jätä se palamaan päälle kokeen ajaksi. Sekoita muovipipetillä.

g 10 sekunnin kuluttua aseta muovipipetillä yksi pisara seosta ensimmäisen jodipisaran päälle. Jodiliuoksen pitäisi muuttua sinimustaksi. Jos jodiliuos jää oranssiksi, reaktio etenee liian nopeasti ja tärkkelys on jo hajonnut. Ruiskuta loput pipetissä olevasta liuoksesta takaisin koeputkeen.

h Odota vielä 10 sekuntia. Poista sitten toinen pisara seoksesta ja lisää se seuraavaan jodipisaraan.

i Toista vaihe h, kunnes jodiliuos ja amylaasi/puskuri/tärkkelys-seos pysyvät oransseina.

j Voisit valmistaa vertailupisaran, jota voit verrata koepisaroihin. Mitä tämän pitäisi sisältää?

k Laske, kuinka monta jodipisaraa olet käyttänyt, kukin vastaa 10 sekunnin reaktioaikaa.

l Toista koko menettely toisella käytettävällä pH-puskurilla tai kokoa luokan tulokset yhteen.

m Harkitse toistokokeiden keräämistä, jos aikaa on.

n Piirrä kuvaaja tärkkelyksen hajoamiseen kuluvasta ajasta pH:n funktiona tai laske reaktionopeus ja piirrä nopeus pH:n funktiona.

Opetusmuistiinpanot

Tämä on suoraviivainen harjoitustehtävä, joka antaa luotettavia ja yksiselitteisiä tuloksia. Tärkeimmät virheet liittyvät entsyymin/substraatin/puskurin sekoitusjärjestykseen tai näytteenoton viivästymiseen, jolloin reaktioaika aliarvioidaan tai nopeus yliarvioidaan.