Tohtori Bang oli hyvin kiinnostunut selkärangattomien verenkiertojärjestelmistä. Hän uskoi, että sellaisten eläinten tutkiminen, joiden verenkiertoa voitaisiin tarkkailla, johtaisi selkärankaisten, kuten ihmisen, fysiologisten prosessien parempaan ymmärtämiseen.
1950-luvun alussa työskennellessään meribiologisessa laboratoriossa Wood’s Holessa, Mainessa, Bang tutki hevosenkenkäravun verenkiertojärjestelmää ja sen reaktiota bakteeri-infektioon.
Hän ruiskutti raikkaasta merivedestä saatuja bakteereja erikokoisiin hevosenkenkärapoihin ja tutki niiden reaktiota. Yleensä veri muodosti pienen hyytymän, joka sulki infektoituneen alueen ja esti bakteerien pääsyn sinne.
Mutta eräänä päivänä Bang huomasi, että yksi hänen ravuistaan oli kuollut tuntemattomaan infektioon, joka oli aiheuttanut sen, että lähes koko ravun veri oli hyytynyt puolikiinteäksi massaksi.
Tällaista ei ollut koskaan ennen nähty!
Niinpä hän eristi ja kasvatti ensimmäisestä eläimestä peräisin olleen bakteerin ja ruiskutti sitä toisiin hevosenkengänravuihin. Niilläkin tapahtui samanlainen hyytyminen ja ne kuolivat.
Tutkittuaan asiaa tarkemmin hän huomasi, että vain “gramnegatiiviset” bakteerit aiheuttivat tämän reaktion.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
Gramnegatiiviset bakteerit aiheuttavat infektioita, kuten keuhkokuumetta ja aivokalvontulehdusta. Kun Bang lämpötappoi bakteerit ennen injektiota, hän sai silti saman hyytymisreaktion. Tämä tarkoitti, että eläviä bakteereja ei tarvittu aiheuttamaan hevosenkenkäravun veren hyytymistä.
Hän julkaisi havaintonsa vuonna 1956 ja jätti alkuperäiset havaintonsa sivuun lähes kymmeneksi vuodeksi.
Tulee Jack Levin.
Vuonna 1963, kun Bang keskusteli hevosenkenkärapuprojektinsa tiedoista, eräs kollegansa ehdotti, että yhteistyö veritautilääkärin (hematologin) kanssa saattaisi ehkä auttaa hyytymissyyn arvoituksellisen kysymyksen ratkaisussa. Kollega suositteli laboratorionsa tutkijakollegaa, tohtori Jack Leviniä.
Levin tutki kaniinien avulla Shwartzmanin reaktiota – reaktiota endotoksiiniin, joka saa aikaan verihyytymän muodostumisen verisuonen sisälle ja muuttaa myös selkärankaisten verihiutaleiden toimintaa.
Endotoksiini on kaikkien gramnegatiivisten bakteereiden soluseinän avainkomponentti; sitä voi olla vaikea havaita, ja lisäksi se on vastustuskykyinen lääkkeille.
Bang suostutteli Levinin viettämään kesän meribiologisessa laboratoriossa Woods Holessa, jossa hän tutki Limuluksen amebosyyttien ja ihmisen verihiutaleiden yhtäläisyyksiä.
Hän osoitti nopeasti, että hevosenkengänravun soluton plasma ei hyytyisi, mutta tutkiessaan verisoluja hänellä oli vaikeuksia saada veri pysymään hyytymättömänä.
Hänellä oli toinenkin ongelma. Näytteet, jotka olivat kunnossa, kun hän lähti laboratoriosta yöllä, hyytyivät, kun hän palasi aamulla, eikä mikään markkinoilla olevista antikoagulanteista vaikuttanut asiaan.
Serendipity Leads to an Aha! Moment
Levin oli ymmällään, ja hän alkoi olla aika epätoivoinen saadakseen selville tämän asian!
Voisiko se johtua bakteereista tai jostain bakteerien osasta?
Testaamaan tätä mahdollisuutta hän valmisti uusia näytteitä steriileissä, endotoksiinittomissa lasiastioissa. Hämmästyttävää kyllä, veri ei hyytynyt!
Tällöin hän tajusi, että hän oli tunnistanut veren hyytymismekanismin, joka laukeaa gramnegatiivisen bakteerin endotoksiinin läsnäolosta.
Viimein hän pystyi osoittamaan, että koko veren hyytymismekanismi Limuluksessa sisältyi amebosyytteihin ja että se oli erittäin herkkä endotoksiinien läsnäololle.
Limulus polyphemus amebosyytit
“Luulen, että vain endotoksiinin parissa työskentelevä tutkija olisi ikinä tullut ajatelleeksi sitä mahdollisuutta, että endotoksiini aiheuttaisi Limuluksen veren hyytymistä”, Levin sanoo.
Tämä johti siihen, että Levin kehitti ja patentoi äärimmäisen herkän Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -testin, jolla pystyttiin testaamaan bakteerien endotoksiinit hevosenkenkäravun verestä.
Asian ainoa muu endotoksiinitesti oli tuolloin nimeltään Rabbit Pyrogen Test. Tuohon aikaan Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (Food and Drug Administration) edellytti, että kaikkien pistettävien lääkkeiden oli läpäistävä Pyrogeenitesti, ennen kuin ne voitiin hyväksyä käytettäväksi.
Kanin Pyrogeenitesti oli kuitenkin kallis, tehoton ja usein epätarkka prosessi.
Näyte ruiskutetaan ryhmään kaneja. Jos näille kaneille nousi kuume, lääke ei läpäissyt testiä. Jos niille ei noussut kuumetta 4-6 tunnin kuluessa, lääke läpäisi testin.
Farmaseuttiset yritykset joutuivat pitämään tuhansia kaneja talossa näiden testien suorittamiseksi.
LAL-testi voi antaa tuloksen jo 45 minuutissa, ja sillä voidaan havaita endotoksiinien esiintyminen alle yhden triljoonasosan tasoilla.
Levin tajusi, että hänellä oli erittäin herkkä ja nopea määritys! Tämä oli kovaa kilpailua kani-testille.
LAL-testi voi antaa tuloksen jo 45 minuutissa, ja sillä voidaan havaita endotoksiinien esiintyminen tasoilla, jotka ovat alle yksi osa biljoonaa kohti.
Vaikka LAL-testi kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1965, kesti lähes 20 vuotta ennen kuin FDA hyväksyi testin virallisesti lopputuotteen endotoksiinitestiksi!
Miksi siinä kesti niin kauan?!
Todettakoon, että ihmiset eivät halua muuttaa asioita, ja yritykset todella vastustavat muutoksia. Uuden, herkemmän testin käyttöönotto merkitsi sitä, että lääkeyhtiöiden olisi pitänyt tehdä uudelleenjärjestelyjä ja perustaa kokonaan uusi tuotantolinja.
Se on aikaa ja rahaa!
Mutta kerma nousee lopulta huipulle; tämä testi oli kerman kärkeä, ja sitä se on edelleen!
LAL:n kysyntä on nykyään niin suurta, että siitä on tullut yksi maailman arvokkaimmista nesteistä, ja sen hinnaksi ilmoitettiin huhtikuussa 2018 35 000-60 000 dollaria gallonalta!
LAL-testin laajentaminen
Johns Hopkinsin Bloomberg School of Public Health on nimittänyt LAL-testin yhdeksi “100 tärkeimmästä panoksesta kansanterveyteen”.
Jack Levinin mukaan LAL-testi on vakioseulontatesti endotoksiinikontaminaation havaitsemiseksi kaikkialla maailmassa, ja se testataan vuosittain noin 17,5 miljoonalla näytteellä (eli noin 70 miljoonalla testillä). Kuva otettu tästä artikkelista MATT DAVIS
Hevosenkenkäravut pyydystetään ja niihin työnnetään putki veren imuroimiseksi (ks. kuva yllä). Sitten kerätty veri sentrifugoidaan amebosyyttien konsentroimiseksi. Veden lisääminen pakattuihin amebosyytteihin saa ne hajoamaan ja vapauttamaan hyytymisproteiineja (lysaattia), jotka reagoivat endotoksiinien kanssa.
Tätä tapaa valmistaa LAL:ia mainostetaan ei-tappavana menetelmänä saada rapujen verta. Mutta se ei ole sitä. Koska kaikki ravut eivät selviä hengissä!
Atlantin osavaltion merikalastuskomission vuoden 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report -raportissa todetaan, että 600 000 hevosenkenkärapua pyydystetään ja vuodatetaan verestä LAL:n vuotuisen kysynnän tyydyttämiseksi.
Näistä 600 000 ravusta noin 420-540 000 (70-90 %) selviää toimenpiteestä. Kun tähän yhdistetään elinympäristön kaventuminen, ilmaston lämpeneminen ja yli 500 000 rapua, jotka pyydystetään ja tapetaan joka vuosi käytettäväksi syöttinä ankerias- ja kuoreenpyyntiä varten, voidaan ymmärtää, miksi hevosenkenkärapukannat ovat romahtamassa.
Ei pelkästään sitä, vaan ravut pyydetään touko- ja kesäkuussa, jolloin ne tulevat joukoittain maihin parittelemaan, munimaan ja toivottavasti säilyttämään selviytymisensä.
Tämä ei ole kestävä tilanne!
Onko olemassa parempia tapoja tehdä LAL:ia?
“Amerikkalainen hevosenkenkärapu eli yli dinosaurusten ja on selvinnyt neljästä aiemmasta joukkosukupuutosta, mutta nyt sitä uhkaavat lääketeollisuus, kalastusyhteisöt, elinympäristöjen häviäminen, ilmastonmuutos ja viimeisimpänä Yhdysvaltojen itärannikon edustalla esiintyvät tukahduttavat punalevävuodet.” Jonathan Wattsin artikkelista The Guardianissa
Tässä valitettavassa tilanteessa on kaksi ensisijaista pyrkimystä, joita mainostetaan keinoina lieventää tätä valitettavaa tilannetta.
Yksi lääketeollisuuden kokeilemaksi lähestymistavaksi on valittu hevosenkengän rapujen vesiviljely.
Alun perin yritykset kasvattaa hevosenkengän rapuja eivät ole onnistuneet kovin hyvin. Näytti siltä, että 3-4 kuukauden viljelyn jälkeen hemolymfaproteiinipitoisuudet laskivat tasolle, joka johti kuolleisuuteen. Näiden kuolemantapausten arveltiin liittyvän ravitsemuksellisiin puutteisiin.
Tohtori Anthony Dellinger on professori Pohjois-Carolinan yliopiston Greensboron neurotieteiden laitoksella ja tutkija Greensborossa, NC:ssä, sijaitsevassa Kepley Biosystems Incorporated -yrityksessä.
Dellinger ja KBI ovat työskennelleet ahkerasti kehittäen uutta, parannettua vesiviljelyjärjestelmää. Heidän lähtökohtanaan on, että “LAL:n hallittu kerääminen valvotuista ja hyvin hoidetuista hevosenkenkäravuista vesiviljelyssä voisi lisätä LAL:n toimitusmääriä, varmistaa lajien elinkelpoisuuden ja mahdollistaa uudet kliiniset innovaatiot.”
Onnistuessaan LAL:n suurempien määrien tuottaminen luotettavasti, kestävästi ja taloudellisesti hyödyttäisi sekä luontoa että teollisuutta.
Dellinger ja kollegat kuvasivat yksityiskohtaisesti, miten heidän vesiviljelyjärjestelmänsä toimii Frontiers of Marine Science -lehdessä viime huhtikuussa julkaistussa artikkelissa.
Katsotaanpa tuon tutkimuksen kohokohtia ja tuloksia.
Ensiksi he optimoivat sisätiloissa kiertävän vesiviljelyjärjestelmän, joka ylläpitää hevosenkengän rapuja luotettavasti. Heidän tavoitteenaan oli helpottaa toistuvaa LAL-korjuuta ja säilyttää samalla eläinten hyvinvointi.
Seuraavana virstanpylväänä oli saada aikaan menetelmä, jonka avulla toistuva korjuumenetelmä olisi mahdollisimman vähän kuormittava. Tätä varten he istuttivat kirurgisesti katetrin hevosenkenkärapuun. Kaikki heidän tekemänsä testit osoittivat, että hevosenkenkäravut sietivät näitä katetreja varsin hyvin.
Tässä lyhyt yhteenveto heidän tuloksistaan.
He keräsivät ja ylläpitivät 24 rapua yhden vuoden ajan 100 %:n eloonjäämisasteella. Hevosenkenkäravut tarkistettiin LAL-aktiivisuuden, munien ja siittiöiden vapautumisen ja muiden sellaisten merkkien varalta, jotka voisivat viitata heikentyneeseen terveyteen. Tällaisia merkkejä ei havaittu.
Ravut vuotivat verta katetreista noin kolme kertaa kuukaudessa, mikä vastaa mahdollisesti noin 36 verenvuotoa rapua kohti 12 kuukauden aikana. Istutetuista katetreista ei aiheutunut ongelmia tämän ajanjakson aikana.
Kun he laskivat aiheutuneet kustannukset, vesiviljelyjärjestelmän alkuperäisen ulkoasun lisäksi, rapujen ylläpidosta tuli noin 0,76 dollaria kilolta, mikä on erittäin edullinen summa!
Tärkein kysymys, johon haluttiin vastata, oli:
Miten itse kasvatetuista hevosenkenkäravuista saatu LAL vertautuu tuoreista ravuista saatuun LAL:iin?
Kuten heidän artikkelinsa kuviosta 6 käy ilmi, vesiviljeltyjen ja luonnonvaraisten rapujen välillä ei ollut merkittävää eroa LAL:n endotoksiinikoagulaatioaktiivisuudessa. Myöskään 1., 16. ja 23. päivänä otettujen verenvuotojen aktiivisuudessa ei ollut todellista eroa.
Näiden tulosten perusteella he päättelivät,
“…vesiviljely voisi vastata teollisuuden tarpeita useiden vuosien ajan 5-10 %:lla yhden vuoden vuotuisesta saaliista, minkä jälkeen luontoon jäisi vuosittain lähes 600 000 HSC-rapua. Itse asiassa nämä havainnot viittaavat siihen, että ∼60 000 vesiviljelyn HSC:tä voitaisiin kestävästi verestää 12-24 kertaa vuodessa ja ylittää nykyisen biolääketieteellisen LAL:n kysynnän.”
Toinen lähestymistapa poistaa rapujen tarpeen kokonaan.
Jeak Ling Dingillä ja hänen aviomiehellään ja tutkimuskumppanillaan Bow Ho:lla Singaporessa oli päämäärä – poistaa hevosenkengän rapujen tarve kokonaan.
Hän tutki Carcinoscorpius rotundicauda -lajia, aasialaista lajia, joka oli paljon pienempi kuin Atlantin hevosenkenkäravut, eikä niistä voinut paljoa vuotaa verta ilman, että ne kuolivat.
Dingin tutkimukset LAL:sta johtivat siihen, että Dingin havaittiin, että tekijä C -niminen molekyyli oli vastuussa sen hyytymisvaikutuksesta. Ding eristi tekijä C:n geenin ja siirsi sen viruksen avulla hyönteisten suolistosoluihin. Tämä käytännössä muutti ötökät pieniksi tehtaiksi, jotka tuottivat tekijä C:tä.
Muunnetut hyönteiset valmistavat riittäviä määriä tekijä C:tä, jota voitaisiin sitten myydä rekombinantti* tekijä C:nä (rFC) markkinoilla LAL:n käyttökelpoisena korvikkeena.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Siten hevosenkengän rapujen sadonkorjuun tai vesiviljelyn ja verenlaskun sijaan he voisivat nyt kasvattaa suuria määriä hyönteisiä ja eristää rFC:tä.
RFC:tä käyttäneet lääkeyritykset ovat vahvistaneet, että se toimii yhtä hyvin kuin LAL, ja tuotantokustannukset ovat vertailukelpoiset.
“Olimme tutkijoina niin innostuneita ja iloisia siitä, että se toimii”, Ding sanoi. “Ja ajattelimme, että rekombinanttitekijä C otettaisiin käyttöön kaikkialla maailmassa, ja hevosenkenkärapu pelastuisi.”
Epäonnekseen rFC:llä oli samat esteet käyttöönotolle kuin LAL:lla, kun se otettiin käyttöön. Vaikka rFC on ollut markkinoilla vuodesta 2003, se on saanut hitaasti jalansijaa. Mutta pikkuhiljaa se on voittamassa esteet, jotka estivät sitä saamasta FDA:n hyväksyntää. Alun perin vain yksi valmistaja valmisti sitä – sveitsiläinen kemikaaliyhtiö Lonza Group.
Vuonna 2013 Hyglos GmbH:sta tuli toinen rFC:tä valmistava yritys. Kevin Williams, Hyglosin vanhempi tutkija, sanoo pitävänsä rFC:n käyttöönottoa ja hyväksyntää jo kauan myöhässä. Hyglos GmbH on saanut hyväksynnän sen käytölle useilta eurooppalaisilta valvontaviranomaisilta.
Tänään asiantuntijat uskovat, että lopulta rFC:stä tulee hallitseva endotoksiinien havaitsemismenetelmä, jolloin hevosenkenkäravut vapautuvat kokonaan teollisen tuotannon koukusta.
Nyt se on jotain, jonka kanssa hevosenkengän rapu voi elää!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Miten pääsemme viimeiseen kysymykseen, jota haluan tarkastella:
Miksi välitämme ylipäätään siitä, selviävätkö hevosenkengän ravut hengissä?
Eivätkö ne ole pelkkiä muinaisjäännöksiä, joita nykyaikainen ekosysteemimme voisi helposti pärjätä ilman? Monet muutkin lajit ovat kuolleet sukupuuttoon ja planeetta näyttää olevan ihan ok.
Tämä on aiheellinen kysymys, joten tutkitaanpa asiaa hieman syvällisemmin.
Polvenkorkuinen vastaus on: “Totta kai haluamme pelastaa ne!”. Meillä on tällä planeetalla jo tarpeeksi olentoja, jotka ovat jo uhattuina tai jotka ovat jo kuolleet sukupuuttoon. Meillä ei vain ole varaa menettää yhtään enempää.”
Kuten sanoin, se on enemmänkin vaistoreaktio, ei vastaus, jonka varaan voi ripustaa hattunsa. Paremman vastauksen saamiseksi meidän on tarkasteltava, miten hevosenkenkäravut sopivat kokonaisuuteen.
Aloitetaan siitä, mitä ne syövät ja mikä niitä syö.
Aikuinen hevosenkenkärapu saalistaa pieniä nilviäisiä, kuten sinisimpukkaa ja surviaissimpukkaa, sekä matoja.
Sinisimpukoita ei ole vakavasti vaarassa vuodesta 2017 lähtien Stony Brookin yliopiston Safina Centerin raportin mukaan. Sama pätee sekä annelidien että surviaissimpukoiden osalta.
Nuoret simpukat syövät pieniä hiukkasia sekä levästä että eläinaineksesta. Eläimen koon kasvaessa myös sen syömä saalis kasvaa.
Kokonaisuutena näyttää siltä, että hevosenkenkäravuilla ei ole haitallisia vaikutuksia saalislajeihinsa.
Okei, se on kolikon toinen puoli. Entäpä toinen puoli? Mikä syö hevosenkenkärapuja?
Hevosenkenkäravun munat ovat ravinnonlähde monille eliöille.
Neihin lukeutuvat muun muassa rantalinnut, eräät kalat – raidallinen ahven, raidallinen killikala, silversidit, kampela – sekä merikilpikonnat, ravut ja kuoreet. Ne ovat kriittinen ravinnonlähde 11 muuttolintulajille. Näiden munien häviäminen tuhoaisi nämä lintukannat.
Loggerhead-merikilpikonnat ja rantalinnut, kuten punasotka, ovat riippuvaisia hevosenkenkäravuista.
Tuhannet näistä kilpikonnista vaeltavat kesäisin Chesapeaken ja Delawaren lahdelle syömään rapuja. Nyt uskotaan, että tukkikilpikonnat kärsivät Chesapeaken hevosenkenkärapujen puutteesta.
Muutamissa tarinoissa kerrotaan, että hevosenkenkärapuja on löytynyt alligaattoreiden ja haiden vatsoista.
Hevosenkenkäravun poikaset voivat myös olla keskeistä ravintoa rannikon ravintoverkossa. Kesän ja syksyn aikana hevosenkenkäravut parveilevat matalikoissa toukkien ja varhaisvaiheen rapujen kanssa. Myös kalat ja rantalinnut ahmivat epäilemättä näitä suupaloja.
Ja näyttää siltä, että monet muutkin eläimet pitävät hevoshevosia varsin maukkaina, ja niille on vaikea löytää helppoa korviketta.
Jopa 450 miljoonaa vuotta eläneen eläimen osalta ymmärryksemme Limulus polyphemuksen roolista rannikon ekosysteemissä ei ole läheskään täydellinen.
Hevosenkenkäravun ekologiaa koskevan tietämyksemme tämänhetkisellä tasolla emme voi tehdä lopullisia johtopäätöksiä siitä, kuinka olennainen rooli niillä on. Se, mitä voimme sanoa, on se, että ne ovat ehdottomasti kapealla alueella, joka vaatii perusteellisempaa tutkimusta.
Siltikin olen niiden suojelun kannalla! Se on minun “parempi katsoa kuin katua” -asenteeni. Tiedämme vain liian vähän antaaksemme Limulus polyphemuksen kaltaisen lajin lipsahtaa sormiemme välistä ja kadota, jos voimme estää sen.
Voitko siis tehdä jotain?
Jos satut asumaan lähellä paikkaa, jonne hevosenkenkäravut tulevat munimaan, on helppo lähteä auttamaan. On olemassa rapujen flippausohjelmia ja rapujen kutututkimuksia, jotka tukeutuvat vapaaehtoisiin.
Ja lopuksi, muistakaa hevosenkenkärapuja, kun käytte lääkärissä. Kaikki, mitä ruiskutetaan tai istutetaan kehoomme, testataan edelleen gramnegatiivisen bakteerikontaminaation varalta hevosenkenkäravun verestä valmistetulla LAL:lla.
Neuvontaan asti
Rich
Hei! Jos pidit tästä artikkelista, tilaa uutiskirjeeni ja saat ilmaisen e-kirjan!
Tietolähteet, joita käytettiin tätä artikkelia varten:
- Hevosenkenkärapu
- Hevosenkenkäravun vesiviljely kestävänä endotoksiinitestauksen lähteenä
- Hevosenkenkäravun rooli biolääketieteellisessä teollisuudessa ja viimeaikaiset suuntaukset, jotka vaikuttavat lajien kestävyyteen
- Sinisen ravun viimeiset päivät
- …Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- This crab could save your life – if humans don’t wipe it out first
- NJ lopetti hevosenkenkärapujen pyynnin. Pitäisikö muiden osavaltioiden tehdä samoin?
- The Horseshoe Crab site created by Kayla Westerlund
- The Atlantic Horseshoe Crab