Kliininen merkitys

Mikrosatelliitti-instabiilisuus (MSI) johtuu deletioiden/insertionien järjestelmällisestä kertymisestä lyhyisiin toistuviin DNA-sekvensseihin kasvainsoluissa, joissa on puutteellinen mismatch repair (MMR) -järjestelmä. MSI:tä esiintyy noin 15 prosentissa kaikista kolorektaalisista syövistä, ja se on kliinisesti hyödyllinen tunnistettaessa potilaita, joilla on MMR-geenien sukusolumutaatioiden aiheuttama perinnöllinen nonpolyposis-kolorektaalisyöpä (HNPCC, Lynchin oireyhtymä). MSI-status voi myös ennustaa syövän vastetta/resistenssiä tietyille kemoterapioille.

Pyrkiessään standardoimaan MSI-analyysin Kansallisen syöpäinstituutin (National Cancer Institute, NCI) vuonna 1997 järjestämässä työpajassa suositeltiin viiden mikrosatelliittimerkkiaineen referenssipaneelia MSI:n havaitsemista varten ja laadittiin MSI-luokitusohjeet tulosten perusteella. Viitepaneeli, jota kutsutaan Bethesda-paneeliksi, koostuu kahdesta mononukleotidilokista (Big Adenine Tract eli BAT-25 ja BAT-26) ja kolmesta dinukleotidilokista (D2S123, D5S346 ja D17S250). Bethesda-paneelin avulla syövät, joissa oli epävakautta kahdessa tai useammassa näistä lokuksista, tulkittiin MSI-korkeaksi (MSI-H), ja syövät, joissa ei ollut epävakautta missään näistä viidestä lokuksesta, katsottiin mikrosatelliittivakaiksi (MSS). NCI:n myöhemmässä seurantaseminaarissa todettiin, että alkuperäisen Bethesda-paneelin herkkyys ja spesifisyys saattoivat olla rajalliset, koska siihen sisällytettiin dinukleotidien toistoja, jotka eivät ole yhtä herkkiä ja spesifisiä kuin mononukleotidien toistot sellaisten syöpien tunnistamisessa, joilla on MMR-puutteita. On ehdotettu, että kvasimonomorfisten mononukleotiditoistojen paneeli voi olla riittävän herkkä ja spesifinen MSI-korkeiden syöpien havaitsemiseen, ja se voi tehdä tarpeettomaksi testattavien kasvainten normaalin sopivan DNA:n (1-8).

MSI Analysis System (Research Use Only kit, Version 1.2, Promega Corporation).

MSI Analysis System on multipleksinen, fluoresoivaan PCR:ään pohjautuva analyysi, jolla voidaan havaita mikrosatelliittisinstabiliteettia. MSI Analysis System sisältää fluoresoivasti leimattuja alukkeita viiden kvasimonomorfisen mononukleotidien toistomarkkerin (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 ja MONO-27) rinnakkaisamplikointia varten. PCR-tuotteet erotetaan toisistaan kapillaarielektroforeesilla (CE) Applied Biosystems 3500Dx Genetic Analyzer -laitteella. Mikrosatelliitti-instabiilius kahdessa tai useammassa mononukleotidilokuksessa tulkitaan MSI-korkeaksi; mikrosatelliitti-instabiilius yhdessä mononukleotidilokuksessa tai ei instabiiliutta yhdessäkään testatussa lokuksessa tulkitaan mikrosatelliittivakaaksi (MSS). Tyypillisesti MSI-korkean MSI:n omaavissa näytteissä esiintyy epävakautta kaikilla lokuksilla, ja tuotteen koko pienenee keskimäärin 5-9 emäksen verran. MSI:n esiintyminen havaitaan vähintään 99 prosentin analyyttisellä spesifisyydellä ja vähintään 5 prosentin havaitsemisrajalla.

MSI-analyysijärjestelmän tärkeä suunnittelutekijä on viiden eri lokuksen välinen etäisyys, joka yleensä ylittää MSI:n esiintyessä tyypillisen emässiirtymän (keskimäärin 5-9 emästä). Pisin PCR-amplikonin koko on 154 emäsparia, mikä on edullista formaliinikiinnitteisen, parafiiniin upotetun kudoksen (FFPE) analysoinnissa.

Tämä määritys on standardi korkean läpimenon rutiinimaisessa MSI-testauksessa, erityisesti silloin, kun samasta DNA-näytteestä pyydetään muita myöhemmän vaiheen molekyylimäärityksiä.

Näytevaatimukset

Määritykseen hyväksyttäviä näytteitä ovat formaliinifiksoidut, parafiiniin sulautetut kolorektaalikarsinooman kudosnäytteet, joiden fiksaatioaika on 6-48 tuntia.

Tilavuus

1 edustava parafiinilohko on suositeltava. Vaihtoehtoisesti resektioiduista näytteistä tarvitaan vähintään 5 värjäämätöntä kudosleikettä (5 µm paksu).

Säilytys- ja lähetysohjeet

Säilytä ja lähetä näytteet huoneenlämmössä.

Rajoitukset

Riittämätön kasvainpitoisuus ei välttämättä mahdollista MSI-instabiilisuuden havaitsemista: 10 %:ia kasvainsoluista vaaditaan. Kasvaimen sisältö arvioidaan ennen analyysia ja suoritetaan makrodissektio. Muut fiksatiivit kuin formaliini tai pitkittynyt fiksaatioaika voivat johtaa riittämättömiin tuloksiin.

Erityisvaatimukset

Ei ole.

Kiertoaika

Viisi-seitsemän arkipäivää, kun kyseessä ovat vastaavasti objektilasit ja parafiinilohkot.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Akkreditointi vireillä

IdyllaTM MSI Assay (RUO) suorittaa mikrosatelliitti-instabiilisuuden havaitsemisen suoraan formaliiniin kiinnitetyistä, parafiiniin upotetuista (FFPE) ihmisen syöpäkudosleikkeistä käyttämällä PCR-reaktiota, jota seuraa korkearesoluutioinen sulamiskäyräanalyysi IdyllaTM-laitteella.

Assay suorittaa mutaatioiden havaitsemisen seitsemässä monomorfisessa homopolymeerisessä lokuksessa mikrosatelliitti-instabiiliuden omaavien ihmissyöpien tunnistamiseksi (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A ja SULF2). Nämä biomarkkerit ovat kasvainspesifisiä, niiden esiintyvyys on suuri paksu- ja peräsuolen ja kohdun limakalvon syövissä, ja ne ovat vakaita eri etnisyyksissä. Lisäksi nämä kasvainspesifiset biomarkkerit eivät edellytä paritettujen normaalien kudosnäytteiden analysointia.

Näytteen MSI-status määritetään kaikkien 7 biomarkkerin lopullisella kutsulla. Mikrosatelliitti-instabiilius kahdessa tai useammassa mononukleotidilokuksessa tulkitaan MSI-korkeaksi; mikrosatelliitti-instabiilius yhdessä mononukleotidilokuksessa tai ei instabiiliutta missään testatuista lokuksista tulkitaan mikrosatelliittistabiiliksi (MSS).

Tämä määritys mahdollistaa alhaisen läpimenoprosentin MSI-testauksen, ja se sopii erinomaisesti reflektio- tai pelastavaan testaukseen, kun halutaan saada nopeasti tarkka MSI-tulos tai vahvistaa se.

Näytevaatimukset

Määritykseen hyväksyttäviä näytteitä ovat formaliinifiksoidut, parafiiniin upotetut kolorektaalikarsinooman kudosnäytteet, joiden fiksaatioaika on 6-48 tuntia.

Tilavuus

1 edustava parafiinilohko on suositeltava. Vaihtoehtoisesti resektionäytteisiin tarvitaan vähintään 2 värjäämätöntä kudosleikettä (5 µm paksu; 50-600mm²).

Säilytys- ja lähetysohjeet

Säilytä ja lähetä näytteet huoneenlämmössä.

Rajoitukset

Riittämätön kasvainpitoisuus ei välttämättä mahdollista MSI-instabiilisuuden havaitsemista: 20 %:ia kasvainsoluista vaaditaan. Kasvaimen sisältö arvioidaan ennen analyysia ja suoritetaan makrodissektio. Muut fiksatiivit kuin formaliini tai pitkittynyt fiksaatioaika voivat johtaa riittämättömiin tuloksiin.

Erityisvaatimukset

Ei ole.

Kiertoaika

Kolmesta viiteen arkipäivään, kun kyseessä ovat objektilasit ja parafiinilohkot.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T ym. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Kvasimonomorfiset mononukleotiditoistot korkean tason mikrosatelliitti-instabiliteettianalyysiä varten. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Mikrosatelliitti-instabiilisuuden (MSI) havaitseminen kolorektaalisyöpänäytteistä uudenlaisella joukolla erittäin herkkiä markkereita IdyllaTM MSI Test -prototyypin avulla. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Päivitetty 23.5.2019

.