Keskustelu

Ihmisen mikrobisto koostuu yli tuhannesta erilaisesta bakteerilajista, ja sillä on merkittävä rooli ihmisen terveydelle edistämällä ravintoaineiden saantia, ehkäisemällä taudinaiheuttajien kolonisoitumista sekä muotoilemalla ja ylläpitämällä normaalia limakalvojen immuniteettia. Tämän suuren bakteerijoukon sisällä LAB-bakteereja (eli laktobasilleja ja bifidobakteereja) sisältävillä probioottisilla lisäravinteilla on väitetty olevan monenlaisia hyödyllisiä vaikutuksia ihmisen terveyteen, kuten ripulin ja tulehduksellisten suolistosairauksien ehkäisyyn tai urogenitaalisten infektioiden ennaltaehkäisyyn. Tietämyksemme biokemiallisista tehtävistä, joita tietyillä lajeilla ja kannoilla on ihmisen terveydelle ja sairauksille, on kuitenkin hyvin rajallista. Tässä tutkimuksessa pyrimme edistämään ymmärrystä nitraatin pelkistysreiteistä valituissa yleisissä bakteerilajeissa, jotka kolonisoivat ihmisen suolistoa, käyttäen in vitro -olosuhteita, jotka sopivat yhteen nitraattipitoisen ruokavalion ja ruoansulatuskanavan limakalvopinnoilla esiintyvien happipitoisuuksien kanssa. Tutkimuksemme ensisijaiset tulokset osoittavat, että: 1) E.coli, fakultatiivinen anaerobinen bakteeri, muuntaa nitraatin nitriitiksi ja sen jälkeen ammoniakiksi, joka vähitellen kerääntyy kasvatusmedioihin; 2) L.plantarum, fermentatiivinen bakteeri, jota kasvatetaan eksogeenisen hemin ja K2-vitamiinin läsnä ollessa, suorittaa samankaltaisia prosesseja; 3) E.coli-entsyymit tuottavat merkittävän määrän NO:ta nitriitistä vain anaerobisissa olosuhteissa; 4) kaikki tutkittavat LAB-peräiset bakteeriviljelyt tuottavat suuria määriä maitohappoa, mikä aiheuttaa kasvatusmedioiden riittävää happamoitumista, joka saa aikaan sen, että nitriitistä muodostuu NO:ta epäsuhteessa.

Useimmat eukaryootit saavat energiansa ensisijaisesti oksidatiivisen fosforylaation avulla, ja niiden on hengitettävä O2:ta ATP:n muodostamiseksi, mutta monet enterobakteerit, mukaan lukien E.coli K12 -kannat, voivat käyttää NO3-:a vaihtoehtoiseksi elektroniakseptoriksi, kun O2 on rajallinen ja nitraattia on runsaasti . E.coli edustaa Enterobacteriaceae-heimon mallijäseniä, ja vaikka tämä perhe muodostaa vain pienen osan suolistomikrobistosta, se on erityisen tärkeä, koska tietyt kannat voivat aiheuttaa sairauksia. Hiljattain on myös osoitettu, että E.coli voi käyttää hengityksen aikana isännän tulehduksen sivutuotteena syntyvää nitraattia kasvuhyötyyn ja kilpailla paksusuolessa elävien mikrobien kanssa, jotka käyttävät ainoastaan käymistä. L. plantarumia pidetään turvallisena probioottina, ja sitä esiintyy yleisesti nisäkkäiden suolistossa sekä ihmisen syljessä, jossa nitraattien tiedetään kertyvän millimolaarisiksi nitraattikierron vuoksi, joka muodostaa noin 25 prosenttia kaikista kiertävistä nitraateista . Tämä bakteeri käyttää LAB-perheen tyypillistä fakultatiivista heterofermentatiivista reittiä, mutta L. plantarum WCFS1 -genomista tunnistettiin hiljattain geenejä, jotka koodaavat oletettua nitraatti-reduktaasijärjestelmää (narGHJI), mikä viittaa siihen, että bakteeri kykenee käyttämään nitraattia elektroniakseptorina . Hiljattain julkaistu L.plantarumin geneettinen analyysi onkin korostanut sen valtavan monipuolista ja monipuolista aineenvaihduntakykyä .

Kokeissamme havaittiin merkittävää nitraattireduktaasiaktiivisuutta sekä E.coli:ssa että L.plantarumissa happijännityksen laskiessa ilmakehän tasolta kohti nollaa. Sitä vastoin B.longum infantis, joka on imeväisten ruoansulatuskanavasta peräisin oleva mikroaerobinen ilmakehää sietävä anaerobi, ei osoittanut kykyä pelkistää nitraattia edes korkeissa pitoisuuksissa. Bifidobakteerit muodostavat jopa 90 prosenttia imeväisen ruoansulatuskanavan bakteereista, ja tuloksemme ovat sopusoinnussa sen havainnon kanssa, että ihmisen rintamaito, jossa on erityisen paljon nitriittiä, tarjoaa ravinnosta saatavan nitriitin lähteen ennen kuin aikuisten normaalifloorassa tavallisesti esiintyvä nitraatin pelkistämiseen kykenevä kieli- ja suolistomikrobisto kehittyy.

Kuvassa 1 osoitimme, että E.coli-viljelmillä, jotka sisälsivät 5 mM NO3-, oli kilpailullinen kasvuetu verrattuna viljelmiin, joihin ei ollut lisätty nitraattia, ja sen jälkeen määritimme happi- ja nitraattigradienttien vaikutuksen nitriitin ja ammoniakin tuotantoon. Tuloksemme osoittavat, että noin 2,5 mM NO3- joko 4 %:n tai alhaisemman O2-arvon vallitessa riittää indusoimaan nitraattireduktaasientsyymien ilmentymisen ja että 24 tunnin kuluttua huomattavan paljon nitriittiä kertyi sekä E.coli-solujen sisälle että kasvatusmediaan. Bakteerien entsyymitoiminnan säätelyn yksityiskohtainen molekyylianalyysi ei kuulu tämän tutkimuksen piiriin, mutta tiedetään hyvin, että E.coli K12 -kannat ilmentävät kolmea molybdeeniä sisältävää nitraattireduktaasia ja että volframi voi deaktivoida nämä entsyymit korvaamalla molybdeeniatomin aktiivisessa kohdassa. Havaitsimme, että 300 μM volframioksidia lisäämällä viljelmiin, joita kasvatettiin kuvassa 1 esitettyjen kokeiden mukaisesti, nitriitin muodostuminen loppui lähes kokonaan (tietoja ei ole esitetty). Näin ollen uskomme, että molybdeenistä riippuvaiset nitraattireduktaasit ovat vastuussa nitriitin muodostumisen ratkaisevasta vaiheesta. On myös tärkeää huomata, että E.coli ja monet muut bakteerilajit ovat alttiita nitriitin myrkyllisyydelle, joka johtuu metalli-nitrosyylikompleksien muodostumisesta, ja ne minimoivat tämän myrkyllisyyden indusoimalla koordinoidusti nitriittikalvokuljettajaa ja muita entsyymejä, jotka välittävät nitriitin pelkistymistä. Täydellinen kuvaus E.colin nitraatti- ja nitriittireduktaasientsyymien geeneistä ja operonien säätelystä ja ilmentymisestä löytyy Stewartin ja Colen erinomaisista julkaisuista.

Typpioksidien pelkistymisreitit ihmisen suolistossa

Nitraatin ja nitriitin esiintyminen ruoansulatuskanavan alemmassa osassa riippuu lukuisista näkökohdista, mukaan luettuina suolistoa kolonisoivien bakteereiden tyypit sekä ruokavalion ja typpioksidien aineenvaihduntareittien välinen mutkikas tasapaino. Nitraatin endogeeninen tuotanto NO:n hapettumisesta (pääasiassa reaktion kautta happi-hemoglobiinin kanssa) on kuitenkin jo pitkään todettu olevan kertaluokkaa suurempi kuin ravinnon saanti, kuten osoitettiin 1970-luvun lopulla ja viime aikoina tutkimuksissa, joissa käytettiin eNOS-puutteellisia hiiriä . Kuvan 5 kaavamaisessa esityksessä on esitetty yhteenveto bakteerien hengitysteitse tapahtuvan denitrifikaation, typen oksidien pelkistymisen ammoniakiksi, endogeenisen L-arginiini/NO-syntaasireitin ja ei-entsymaattisen nitriitin pelkistymisen NO:ksi välisestä yhteydestä. Denitrifikaatioprosessissa (punainen laatikko) nitraatti pelkistyy typpikaasuksi (N2) nelivaiheisessa prosessissa, jossa nitriitti, NO ja dityppioksidi ovat elektronin vastaanottajia energiaa tuottavissa reaktioissa. Hiljattain on osoitettu, että ihmisen hammasplakissa on täydellinen denitrifikaatioreitti, joka johtaa N2:n tuotantoon, ja vaikka sen merkitystä ihmisessä pidetään edelleen vähäisenä, arvelemme, että sillä saattaa olla tärkeä merkitys hyvin alhaisessa happipitoisuudessa nitraatin läsnä ollessa, eikä N2:n muodostumista ihmisen suolistossa voida sulkea pois. Denitrifikaatio ja dissimilatorinen nitraatin pelkistyminen ammoniakiksi (DNRA, sininen laatikko) jakavat ensimmäisen nitraatin pelkistymisvaiheen nitriitiksi, ja tähän reaktioon on yhdistetty useita nitraattireduktaasiluokkia. DNRA:ssa toinen vaihe on nitriitin suora pelkistäminen kuudella elektronilla ammoniakiksi, mikä ei tuota energiaa, mutta on melko yleinen detoksifikaatioprosessi fakultatiivisissa anaerobisissa bakteereissa. DNRA:n on ehdotettu edustavan nisäkkäiden pötsissä tapahtuvan nitraattiaineenvaihdunnan pääreittiä. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin ammoniakkia nitraatin pelkistymisen tuotteena E.coli- ja Lactobacilli-bakteereissa, joita kasvatettiin mM nitraatin läsnäollessa 4 %:n happipitoisuudessa tai sitä alhaisemmissa pitoisuuksissa.

Expand

Respiraattorinen denitrifikaatio voi myös tuottaa pieniä, mutta merkityksellisiä määriä NO:ta välituotteena, ja sen on arveltu olevan osallisena NO:n tuotannossa suolistossa . Muita mahdollisia NO:ta tuottavia reittejä ovat nitriitin hapan muuntuminen (vihreä laatikko) ja L-arginiinin hapettuminen NOS-entsyymien toimesta (ruskea ympyrä). Kuvassa 4C tarkastelimme nitriitin ei-entsymaattisen disproportionoinnin protoniriippuvuutta ja osoitimme, että se tulee merkitykselliseksi vain silloin, kun solunsisäinen tai kehon nesteiden pH on alle 5,5. Tuloksemme sulkevat pois myös aktiivisten NOS-entsyymien esiintymisen E.coli- ja L.plantarum-organismeissa, mutta suoliston epiteelisolujen tiedetään tuottavan NO:ta sekä endoteelisten että indusoituvien NOS-isoformien ilmentymisen kautta. Mielenkiintoista on, että NO:n tuotanto suolistossa voisi käynnistyä myös peroksidaasien entsymaattisista prosesseista, joita esiintyy runsaasti suolen limakalvon soluissa ja joiden on osoitettu käyttävän nitriittiä substraattina tuottaakseen NO:ta osana antibakteerista vaikutustaan.

Uskomme, että kaikki nämä erilaiset nitraatin pelkistymisreitit voivat esiintyä rinnakkain ja yhtäaikaisesti, joskin on todennäköistä, että vain yksi aineenvaihduntatuotteista olisi vallitsevana erityisistä fysiologisista olosuhteista riippuen.

Bakteerien nitraattipelkistyksen avulla tapahtuvan NO:n muodostumisen fysiologinen merkitys

Ruokavalion nitraatti ja nitriitti kuvataan edelleen monissa tutkimuksissa mahdollisina myrkyllisinä aineina huolimatta lisääntyvästä todistusaineistosta, jonka mukaan NO:n tuotannolla näistä ioneista on merkittäviä hyödyllisiä vaikutuksia sydän- ja verisuonijärjestelmän, immuunijärjestelmän ja ruoansulatuskanavan toimintoihin . Suolistossa NO:lla on useita fysiologisia tehtäviä, kuten limakalvon verenkierron, suoliston liikkuvuuden ja liman paksuuden säätely. NO:n krooninen ylituotanto on liitetty myös tulehduksellisiin suolistosairauksiin, ja se todennäköisesti estää monien eri bakteerilajien kasvua. Aiemmat tutkimukset jättivät epäselväksi, miten suolistobakteerit tuottavat NO:ta, mutta Sobko ym. kuitenkin osoittivat, että toisin kuin tavanomaisilla rotilla, NO-pitoisuudet itiöttömän rotan suolistossa ovat erittäin alhaiset, ja kun siihen istutettiin normaali bakteerifloora, havaittu NO-tuotanto lisääntyi kymmenkertaiseksi.

Kokeissamme happi- ja protonipitoisuudet määrittivät nitraatin NO:ksi pelkistymisen spesifisen reitin. Kuvassa 4A esitetyt tulokset osoittavat, että E.coli kykenee entsymaattiseen NO-aktiivisuuteen anaerobisissa olosuhteissa, joissa nitraattipitoisuudet ovat yli 1 mM, mahdollisesti denitrifikaation tai periplasmisen sytokromi-c-nitriittireduktaasientsyymin (Nrf) kautta, kuten Corker ja Poole ovat ehdottaneet. Tämä NO:n muodostuminen vähenee kuitenkin huomattavasti, kun happipitoisuus on 2 %, ja siitä tulee nitraatista riippumaton. Tärkeää on, että tietomme ovat yhdenmukaisia Sobkon ja kollegoiden raportin kanssa, jonka mukaan E. coli tuotti merkityksettömiä NO-pitoisuuksia 24 tunnin inkuboinnin aikana 0,1 mM nitraatin kanssa . LAB tuotti huomattavia määriä NO:ta vastauksena väliaineen happamoitumiseen maitohapon kertymisen vuoksi. Kasvualustan korvaaminen tuoreella LMRS:llä (pH = 6,5) esti lähes kokonaan LAB-viljelmien kyvyn muuntaa nitriittiä NO:ksi, mutta ei E.colilla. Suoliston pH-mittaukset vaihtelevat välillä 5,7-7,5, joten in vivo nitriitin epäsuhtaistuminen on todennäköisesti vähäinen ja paikallinen osa NO:n tuotantoa. Päinvastoin, tämä polku on vakiintunut ilmiö mahalaukun happamassa ympäristössä (pH noin 3).

Yhteenvetona ehdotamme, että suoliston limakalvon läheisyydessä olevien suolistobakteerien tuottama NO voi joko harjoittaa edellä mainittuja suotuisia vaikutuksia tai korkeammilla pitoisuuksilla häiritä näitä toimintoja. Näin ollen bakteerien NO:n muodostumista suolistossa voidaan pitää sekä fysiologisten että patologisten vaikutusten modulaattorina.

Bakteerien ammoniakin muodostumisen fysiologiset vaikutukset terveyteen

Koolonbakteerien tiedetään tuottavan ammoniakkia aminohappojen deaminaatiosta tai ureaasin välityksellä, joka on urean hydrolyysi hiilidioksidiksi ja ammoniakiksi, Vincen ym. 1970-luvun alkupuoliskolla tekemistä uraauurtavista tutkimuksista lähtien . Hiljattain Cole ja kollegat raportoivat, että E.coli -bakteerin nitriittipelkistyksen päätuote on ammoniakki, josta vain noin 1 % pelkistyy NO:ksi neutraalissa pH:ssa. Tutkimuksessamme saadut tulokset viittaavat siihen, että ainakin tietyt yleiset suolistobakteerit pelkistävät nitriitin ensisijaisesti ammoniakiksi eikä NO:ksi. Terveillä koehenkilöillä tavanomaisissa fysiologisissa olosuhteissa suurin osa ruoansulatuskanavan alaosassa syntyvästä ammoniakista erittyy sitten kehon nesteisiin ja metaboloituu maksan hepatosyyteissä, joissa ammoniakki ja hiilidioksidi muunnetaan entsymaattisesti karbamoyylifosfaatiksi, joka osallistuu reaktiosarjaan, jota kutsutaan nimellä “urea-sykli” ja joka johtaa urean muodostumiseen ja sen poistumiseen munuaisissa (ks. kuva 5). Ammoniakin normaali pitoisuus plasmassa on välillä 10-35 μM, mutta kun ammoniakkituotanto on liiallista, portaaliveressä oleva ammoniakki voi ohittaa maksan ja johtaa hyperammonemiaan. Veressä oleva ammoniakki läpäisee vapaasti veri-aivoesteen, ja korkeilla pitoisuuksilla (>100 μM) on toksisia vaikutuksia keskushermostoon, mikä johtaa enkefalopatiaan ja lopulta koomaan. Maksakirroosipotilaille kehittyy hyvin usein maksan enkefalopatia (HE) . Jos maksan vajaatoimintaa ei ole, hyperammoneeminen kooma on johtunut ureaasiin kykenevien mikro-organismien, kuten Klebsiella-keuhkokuumeen, aiheuttamasta sepsiksestä . HE:n klassisiin hoitomenetelmiin kuuluu systeemisen ammoniakkipitoisuuden alentaminen antibioottihoidolla (suoliston ammoniakkia tuottavien bakteerien tappamiseksi) ja imeytymättömien sokerien, kuten laktuloosan ja laktitolin, antaminen. Paksusuolessa paksusuolen bakteerit hajottavat laktuloosan pääasiassa maitohapoksi ja myös pieniksi määriksi muurahais- ja etikkahappoa . Tämä happamoituminen edistää imeytymättömän ammoniumionin muodostumista ammoniakista ja vähentää sen pitoisuutta plasmassa. On epäselvää, missä määrin ravinnon nitraatti vaikuttaa ammoniakkipitoisuuteen suolistossa ja veressä, mutta ehdotamme vaihtoehtoista hypoteesia, jonka mukaan paksusuolen sisällön lisääntynyt happamoituminen laktuloosan läsnäolon vuoksi suosii mikrobiston nitriitin muuttamista NO:ksi ammoniakin sijasta tunnetun happo-riippuvaisen mekanismin avulla.

Johtopäätökset

Yli 30 vuoden ajan eksogeenisen nitraatin biologista kohtaloa ei ole voitu selittää erittyvillä typpeä sisältävillä yhdisteillä, joiden osuus on noin 60 % ihmisen nauttimasta nitraattiannoksesta. Tuloksemme tukevat ajatusta, että syljen, mahalaukun, ohutsuolen ja paksusuolen bakteerit muuttavat nitraatin nitriitiksi ja sen jälkeen muiksi pelkistyneen typen biomolekyyleiksi, kuten NO:ksi, ammoniakiksi, ureaksi ja mahdollisesti typpikaasuksi. Kysymykset siitä, kuinka paljon ammoniakkia syntyy nitraatti-nitriitti-pelkistyksestä verrattuna muihin tärkeisiin prosesseihin, kuten deaminaatioon ja bakteerien ureaasiaktiivisuuteen, edellyttävät yksityiskohtaisia aineenvaihduntatutkimuksia eläimillä ja/tai ihmisillä. Ravinnon nitraattien muuntumisen biologinen merkitys suolen luumenissa on vielä selvittämättä. Perinteisen japanilaisen ja Välimeren ruokavalion, joilla tiedetään olevan sydän- ja verisuonitauteja suojaavia vaikutuksia, keskimääräinen nitraattien saanti henkeä kohti on kuitenkin 2-3 kertaa suurempi kuin tyypillisessä länsimaisessa ruokavaliossa (Yhdysvalloissa se vastaa noin 40-100 mg nitraattia päivässä). Symbioottisten bakteerien, typen oksidien aineenvaihdunnan ja ihmisen terveyden välistä yhteyttä on tutkittava lisää; on kuitenkin selvää, että nisäkkäiden typpiaineenvaihdunnan biologiset reitit ovat monimutkaisempia ja tärkeämpiä kuin vielä muutama vuosi sitten ajateltiin.