Solusykli pitkin maissin alkujuurta
Maissin alkujuuri jaettiin peräkkäisiin segmentteihin, jotka osoittivat juuren lakkiosan, apikaalisen meristeemin pidentymisvyöhykkeen ja erilaistumisvyöhykkeen rajat aiempien tulosten mukaan (Alarcón ym., 2016). Etäisyys RCJ:stä juuren kärkeen arvioitiin 457 µm:ksi, joka poistettiin ennen juuren jakamista useisiin vyöhykkeisiin. Juuren apikaalinen meristemaattinen vyöhyke (MZ) sijaitsee juuren apikaalisimmassa 1,5 mm:n päässä RCJ:stä ja siirtymävyöhyke (TZ) jatkui 3 mm:iin. Nopean pidentymisen vyöhyke (EZ), jossa solut pidentyvät nopeasti, määriteltiin 3-6 mm:n alueelle; ja alueilla, jotka ovat kaukana 6 mm:n etäisyydellä, havaittiin, että solujen pidentymisnopeus alkaa laskea, mikä osoittaa kasvun päättyvän vyöhykkeen (Verbelen et al., 2006). Vyöhykkeet, jotka sijaitsevat 12-20 mm ja 20-30 mm etäisyydellä RCJ:stä, ovat erilaistumisvyöhykkeitä (DF), joissa sivujuuret aloittavat kehityksensä. Arabidopsiksessa on tehty samanlaisia juurten leikkauksia, joissa juuri leikattiin viiteen osaan, jotka ovat lyhyempiä kuin maissin juuressa (Cools ym., 2010). Äskettäin on raportoitu erilainen geeniekspressio pitkin Arabidopsis-juurta, ja tukahdutetut tai indusoidut geenit vaihtelevat enimmäkseen siirryttäessä meristemaattiselta vyöhykkeeltä siirtymävyöhykkeelle sekä siirtymävyöhykkeeltä pidentymisvyöhykkeelle (Chaiwanon ja Wang, 2015).
Juuren meristemin raja määräytyy solusyklin ulostulon ja solunjakautumisen ja solunpidennyksen välisen tasapainon mukaan (Perilli ym., 2012). Virtaussytometriaprofiili osoittaa solusyklin etenemisen pitkin primaarijuurta, ja tiedot, jotka osoittavat suhteellisten solujen määrän solusyklin vaiheissa, osoittavat solujen aktiivisuuden useilla juurivyöhykkeillä. Kun solut poistuvat solusyklistä, ne saattavat siis lopettaa syklin. Lisäksi yleisesti oletetaan, että solujen poistuminen solusyklistä tapahtuu mitoosin jälkeen, ja päätös uuteen solusykliin siirtymisestä tehdään G1-S-siirtymävaiheessa vasteena kasvutekijöille ja erilaisille hormoneille (Gutierrez ym., 2002; Inzé ja De Veylder, 2006; Polyn ym., 2006), 2015).
Kuvassa 1 osoitamme, että 30 °C:ssa kasvatetuissa 150-160 mm:n juurissa meristemi rajoittuu käytännössä MZ:hen, vyöhykkeeseen 0-1,5 mm:n etäisyydellä RCJ:stä, jossa G0/G1-, S- ja G2/M-vaiheessa olevien solujen prosentuaaliset osuudet olivat vastaavasti noin 27, 23 ja 39 (taulukko 1). G1-, S-, G2- ja M-vaiheiden suhteellinen kesto Allium-meristemissä on arvioitu 26,5, 44,5, 16,5 ja 12,5 prosentiksi (Giménez-Martín et al., 1977), ja nämä prosenttiosuudet ovat hyvin samankaltaisia muilla lajeilla. Vaikka tulostemme mukaan maissin meristemissä on vähemmän S-vaiheessa olevia soluja, arvot (23 %) riittivät osoittamaan solusyklin etenemistä (Reichheld ym., 1999). Nämä suhteelliset osuudet muuttuivat poikkeuksellisen paljon, kun TZ analysoitiin, tässä vyöhykkeessä. Prosenttiosuudet olivat 9, 10 ja 68 % G0/G1-, S- ja G2/M-vaiheissa. Tämä tulos viittaa siihen, että solut alkoivat poistua solusyklistä, kun ne olivat 1,5 mm:n päässä RCJ:stä. Lisäksi EZ:n prosenttiosuudet viittasivat siihen, että 3 mm:n kohdalla solut ovat poissa solusyklistä (kuva 1, taulukko 1). Lisäksi G0-G1- ja S-vaiheessa olevien solujen prosenttiosuuden vähenemistä kompensoi G2-M-vaiheen lisääntyminen (taulukko 1, kuva 2). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että solut pysäyttävät solusyklin, kun ne ovat G2-vaiheessa.
Solupopulaation jakautuminen useisiin solusyklin vaiheisiin pitkin juuren kärkeä. Juuria kasvatettiin vesiviljelyssä 30 °C:ssa 150-160 mm:n pituiseksi. Tiedot ovat yksittäisestä edustavasta kokeesta, jossa käytettiin vähintään 10 000 solua prosenttiosuuksien arvioinnissa eri etäisyyksillä RCJ:stä. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena.
Taulukko 1.
Lämpötilan vaikutus solusykliin maissin juuren apexin useilla vyöhykkeillä
Lämpötilan vaikutus solusykliin maissin juuren apexissa. DNA-pitoisuuden frekvenssihistogrammit, jotka edustavat 20 °C:ssa ja 30 °C:ssa kasvatetun maissin juuren kärjen useista osista peräisin olevia soluja. Vasemmassa pylväässä ovat 30 °C:ssa kasvatetuista juurista saadut histogrammit, oikeassa pylväässä 20 °C:ssa kasvatetuista juurista saadut histogrammit. Juuret oli jaettu useisiin segmentteihin: 0-1,5 mm (A,G); 1,5-3 mm (B,H); 3-6 mm (C,I); 6-12 mm (D,J); 12-20 mm (E,K) ja 20-30 mm (F,L). Tiedot ovat yksittäisestä edustavasta kokeesta, jossa on käytetty vähintään 10 000 solua. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena.
On raportoitu, että suurin osa solutyypeistä poistuu meristemistä G1-vaiheessa, ja viime aikoina G1-S-siirtymä käynnistyy vain perikulaarisissa soluissa sivujuuren käynnistämiseksi (Vanneste ym., 2007). Arabidopsiksen perisyklissä protoksilemin napojen viereisten solujen on ehdotettu jatkavan solusykliä keskeytyksettä, kun ne kulkevat siirtymä-, pidentymis- ja erilaistumisvyöhykkeiden läpi (Dubrovsky ym., 2008). Nämä solut ovat ainoat, jotka jakautuvat aloittaakseen sivujuuren primordioita. Muut juuren muodostavat solut eivät kuitenkaan jakaudu. Tällöin epidermiksen ja kuoren solut, jotka muodostavat suurimman osan juuren kudoksista, eivät jatka sykliä poistuessaan juuren meristemistä.
Analyysissämme havaitsimme huomattavaa G2-vaiheen solujen lisääntymistä TZ:ssä ja EZ:ssä. Tämä tulos viittaa siihen, että meristemistä G2-vaiheessa lähtevät solut eivät käy läpi mitoosia, vaan ne pysähtyvät tähän G2-vaiheeseen ja jäävät siihen. Oletamme, että solut, jotka poistuvat meristemistä G1- tai S-vaiheessa, jatkavat solusykliä G2-vaiheeseen, jossa ne pysähtyvät. Tämä perustuu havaintoon, että G0/G1-vaiheessa olevien solujen prosenttiosuuden väheneminen MZ:n ja TZ:n välillä (29,7 %) kompensoituu G2-vaiheen lisääntymisellä (28,8 %) (taulukko 1, kuva 2). G2-prosenttiosuus vähenee heikosti EZ:n ja DZ:n basaalisen pään välillä (20-30 mm RCJ:stä). Tätä pientä vähenemistä yhdessä hyperploidisten ydinten määrän vähenemisen kanssa kompensoi hypoploidien määrän lisääntyminen (taulukko 1).
Toisaalta on raportoitu, että maissin kärkijuuren TZ ei osallistu mitoottisiin jakautumisiin, ja tässä vyöhykkeessä postmitoottiset ytimet sijaitsevat solun sisällä keskeisellä paikalla (Baluška ym., 2001). Lisäksi mitoottisia lukuja ei ole havaittu pitkin juurivyöhykettä; sivujuuren alkusolmujen käynnistyminen havaittiin 20-25 mm:n päässä RCJ:stä (Alarcón ym., 2016). Arabidopsiksessa keskimääräinen etäisyys varhaisimpaan mitoosiin perikulaarissa on 3194 µm ja ensimmäinen mitoosi on havaittu 2205 µm päässä juuren kärjestä (Dubrovsky ym., 2001). Maissin juuressa vasta 20-30 mm:n etäisyydellä RCJ:stä joissakin perisykliä vastapäätä olevissa kyleemisoluissa näkyi kondensoitunutta sytoplasmaa, mikä viittaa siihen, että ne ovat tulossa uudelleen solusykliin (Alarcón ym., 2016). Nämä erot saattavat johtua maissin suuremmasta juuren pidentymisnopeudesta, sillä se kasvaa 80-90 mm/vrk, kun taas Arabidopsis pidentyy vain 10 mm/vrk (Dubrovsky ym., 2001).
Kudoskohtaisen kvantitatiivisen mikroskooppisen analyysin avulla on osoitettu, että jotkin aivokuoren ja epidermiksen solut olivat pidennyksen alkaessa ensimmäisessä endosyklissä (DNA-pitoisuudet välillä 4C ja 8C). Lisäksi siirtymävyöhykkeellä sijaitsevien metaksyleemielementtien ytimissä oli yksi tai kaksi endosykliä, jotka saavuttivat 32 C:n lämpötilan niiden nopean pidentymisen alkaessa (Baluška, 1987, 1990; Baluška ja Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Äskettäin on kuvattu, että endoreduplikaatio tapahtuu kasveissa ennen kuin solut aloittavat erilaistumisen (De Veylder ym., 2007). Emme kuitenkaan havainneet merkityksellistä määrää ytimiä, joiden ploidiataso oli yli 4n. Lisäksi, jos endoreduplikaatio olisi yleinen prosessi maissin juuren kärjessä, olettaisimme hyperploidian lisääntyvän, kun analysoimme vyöhykkeitä, jotka ovat kauempana RCJ:stä. Hyperploidia ei kuitenkaan lisääntynyt vyöhykkeillä, jotka pidentyvät, vaan väheni (taulukko 1).
On raportoitu, että perisyklin solut pysyvät G1-vaiheessa, kunnes ne palaavat solusykliin (Vanneste et al., 2007). Perisyklisolut edustavat kuitenkin vain pientä murto-osaa juuren kärkeä muodostavien solujen kokonaismäärästä; epidermisolut ja kuoren solut ovat runsaimmat solutyypit juuren kärjessä. Jos siis noin 70 % kaikista soluista poistuu meristemistä G2-vaiheessa, suurimman osan epidermisoluista ja kuoren soluista on oltava G2-vaiheessa, kun ne poistuvat meristemistä. Oletetaan, että epidermis- ja cortex-solujen pidentyminen kontrolloi juuren pituussuuntaista kasvua (Alarcón ym., 2014b). Siksi juuren pidentymiseen johtavaan erilaistumisprosessiin osallistuvien solujen pitäisi olla G2-vaiheessa.