TULOKSET JA KESKUSTELU
A375-melanoomasolulinjaa, jolla oli konstitutiivisesti aktivoitunut MAPK BRAFV600E-mutaation vuoksi, käsiteltiin MEK-estäjällä U0126:lla pitoisuudessa 25 μM 8 tunnin ajan, minkä seurauksena ERK:n fosforylaatio tukahdutti ERK:n fosforylaatioita (kuvio 1 a). Immuunisuppressiivisten liukoisten tekijöiden mRNA:t, mukaan lukien IL-6, IL-10 ja VEGF, vähenivät merkittävästi U0126-hoidon myötä (kuva 1 b), kun taas DMSO-kontrollihoito ei vaikuttanut IL-10- ja VEGF-mRNA:n tuotantoon ja lisäsi vain hieman IL-6-mRNA:n tasoa. 18 tunnin altistus U0126:lle tukahdutti myös IL-10:n, VEGF:n ja IL-6:n tuotantoa proteiinitasolla, mikä osoittaa, että aktivoituneet ERK:t voivat olla vastuussa paikallisten immuunivasteiden tukahduttamisesta melanoomaa vastaan tuottamalla näitä immunosuppressiivisia tekijöitä (kuva 1 c). Lisäksi ERK-fosforylaation tukahduttaminen ja IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotannon estäminen tapahtui myös sen jälkeen, kun U0126-käsittelyn pitoisuutta oli vähennetty 10 μM:iin (ei kuvattu). Tämän tutkimuksen aikana A375-solujen U0126-käsittelyllä ei havaittu merkittäviä sytotoksisia vaikutuksia. Vaikka U0126:n tiedetään estävän MEK1/2:n lisäksi myös MEK5:tä, A375-soluissa ei havaittu fosforyloitua ERK5:tä, joka on MEK5:n substraatti (ei kuvattu), mikä osoittaa, että MEK1/2-ERK1/2-reitti on vastuussa U0126-hoidon yhteydessä havaituista vaikutuksista. U0126:n IL-10:n ja VEGF:n tuotantoa hillitsevät vaikutukset osoitettiin myös kolmessa muussa BRAFV600E-mutaatiolla varustetussa melanoomasolulinjassa, 624mel, 888mel ja 928mel, ilman merkittävää solutoksisuutta (kuva 1 d). Koska nämä melanoomasolulinjat eivät tuota IL-6:ta, aktivoituneella MAPK-signaloinnilla näyttäisi olevan yleinen rooli immunosuppressiivisten tekijöiden IL-10:n ja VEGF:n tuotannossa BRAFV600E+-melanoomasolulinjoissa.
Vähentää immunosuppressiivisten liukoisten tekijöiden IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotantoa melanoomasolulinjoissa, joissa on konstitutiivisesti aktiivinen MAPK BRAFV600E-mutaation kautta, estämällä MAPK-signalointia MEK-inhibiittorilla, U0126. (a) ERK1/2:n fosforylaation esto havaittiin Western blot -analyysillä A375mel-melanoomasolulinjasta, jossa on BRAFV600E-mutaatio, ennen ja 2, 4, 6 ja 8 tuntia sen jälkeen, kun sitä oli käsitelty MEK-inhibiittorilla U0126, jonka pitoisuus oli 25 μM. (b) Immunosuppressiivisten liukoisten tekijöiden IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n mRNA-ekspression esto A375-soluissa. Eri liukoisten tekijöiden, kuten IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n, mRNA:t mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR:llä ennen U0126-käsittelyä ja 2, 4, 6 ja 8 tuntia sen jälkeen. Kontrollihoito suoritettiin DMSO-liuoksella. Kunkin ajanhetken mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH:n mRNA:han ja ilmoitettiin suhteellisena arvona 0 h:n arvoon nähden. (c) IL-6-, IL-10- ja VEGF-proteiinien vähentynyt tuotanto A375-soluista 18 tunnin hoidon jälkeen U0126:lla, jonka pitoisuus oli 25 μM. Ekspressio havaittiin ELISA-menetelmällä viljelmän supernatanttien avulla. U0126-käsiteltyjen solujen DMSO-käsiteltyjen solujen elinkelpoisuuden suhde sadonkorjuun yhteydessä oli 77 %. Sytokiinituotanto normalisoitiin DMSO:lla käsiteltyjen kontrollisolujen arvoon solumäärän perusteella. Western blot osoitti ERK:n fosforylaation voimakasta estymistä, mutta ei STAT3-proteiinin tai sen fosforylaation estymistä Ser727:ssä ja Tyr705:ssä. (d) IL-10:n ja VEGF:n vähentynyt tuotanto kolmesta BRAFV600E-mutaation omaavasta melanoomasolulinjasta, 624mel, 888mel ja 928mel, sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty 18 tuntia U0126:lla 25 μM:n pitoisuudella, mikä havaittiin ELISA:lla viljelynesteistä. U0126:lla käsiteltyjen solujen ja DMSO:lla käsiteltyjen solujen elinkelpoisuuden suhdeluvut sadonkorjuun aikaan olivat 95 % 624mel:llä, 103 % 888mel:llä ja 100 % 928mel:llä. Sytokiinituotanto normalisoitiin DMSO:lla käsiteltyjen kontrollisolujen arvoon solumäärän perusteella. Western blot osoitti ERK-fosforylaation voimakasta estoa, mutta ei STAT3-proteiinin estoa. STAT3:n Ser727-fosforylaation lievää vähenemistä havaittiin 888mel- ja 928mel-soluissa, mutta ei 624mel-soluissa. Nämä tulokset edustavat kolmea tai neljää riippumatonta koetta, joissa saatiin samankaltaisia tuloksia.
U0126:n epäspesifisiä vaikutuksia sytokiinituotantoon muiden reittien kuin MAPK-signalisaation kautta ei voida kuitenkaan täysin sulkea pois näiden kokeiden perusteella, koska STAT3:n fosforylaation lievää vähenemistä Ser727:ssä havaittiin 888mel- ja 928mel-soluissa (kuva 1 d). BRAFV600E-mutaatiosta johtuvan aktivoituneen MAPK:n roolin vahvistamiseksi IL-10:n, VEGF:n ja IL-6:n tuotannossa BRAFV600E-spesifinen RNAi transfektoitiin kolmeen melanoomasolulinjaan, A375:een, 888mel:iin ja 624mel:iin, BRAFV600E-spesifistä lyhyttä hiusneulan RNA:ta (shRNA) ilmentävällä lentiviruksella (11). BRAFV600E-spesifinen RNAi esti merkittävästi IL-10:n, VEGF:n ja IL-6:n tuotantoa sekä tukahdutti ERK-fosforylaatiota (kuva 2). Nämä tulokset vahvistavat, että näiden tekijöiden estäminen U0126:lla (kuva 1) korreloi MAPK-reitin spesifisen estämisen kanssa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia viimeaikaisten julkaisujen kanssa, jotka osoittavat ERK1/2:n indusoimaa IL-10:n tuotantoa hiiren makrofageissa (12) ja BRAFV600E:stä riippuvaista VEGF:n tuotantoa angiogeneesin edistämiseksi (13).
Kolmen melanoomasolulinjan, joissa on BRAFV600E-mutaatio, immunosuppressiivisten faktorien IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotantoa on vähennetty BRAFV600E- spesifisellä RNAi:llä. Kolme melanoomasolulinjaa, joissa oli BRAFV600E-mutaatio, A375mel, 888mel ja 624mel, infektoitiin lentovirusvektoreilla, jotka koodasivat lyhyttä hiusneula-RNA:ta joko tulikärpäslukiferaasin mRNA:lle (GL3B; kontrollina) tai BRAFV600E:n mRNA:lle (BRAF#1′) infektiokertoimella 50 tai 100. Proteiinit uutettiin 5 tai 6 d infektion jälkeen ja niille tehtiin Western blot -analyysi. BRAFV600E-spesifisellä RNAi:lla havaittiin ERK1/2:n fosforylaation voimakas väheneminen BRAF-proteiinin vähenemisen myötä. STAT3-proteiinissa ja STAT3:n fosforylaatiossa Ser727:ssä tai Tyr705:ssä ei havaittu merkittävää eroa. Fosforylaation vähäistä vähenemistä Ser727:ssä havaittiin 888mel- ja 624mel-soluissa BRAF RNAi:n jälkeen. 5 tai 6 d lentivirusinfektion jälkeen sama määrä melanoomasoluja annosteltiin tiheydellä 1-2 × 106 solua/2 ml, ja 18 h:n jälkeen viljelyn supernatantit tutkittiin ELISA-testillä IL-6:n, IL-10:n tai VEGF:n osalta. IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n huomattavaa vähenemistä havaittiin. Kuvassa on yksi edustava tulos kahdesta tai kolmesta riippumattomasta kokeesta, joissa saatiin samankaltaisia tuloksia.
Koska aktivoidun STAT3-signaloinnin on todettu johtavan syövän aiheuttamaan immuunipuolustukseen erilaisten tekijöiden, mukaan lukien VEGF:n, tuottamisen kautta (8, 9), selvitimme MAPK- ja STAT3-reittien välistä suhdetta koskien immunosuppressiivisten tekijöiden tuottamista melanoomasolulinjan A725 solulinjassa. IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotanto estyi syvästi RNAi:lla, joka kohdistui joko pelkkään BRAFV600E:hen tai pelkkään STAT3:een (kuva 3 a). BRAF-MAPK- ja STAT3-reittien samanaikaisella rajoittamisella ei havaittu selvää additiivista tai synergististä vaikutusta (kuva 3 a). BRAFV600E RNAi A375-soluissa ei vähentänyt STAT3:n DNA-sitoutumisaktiivisuutta (kuva 3 b), STAT3:n promoottoriaktiivisuutta (kuva 3 c) eikä STAT3:n fosforylaatiota Ser727:ssä tai Tyr705:ssä (kuva 2), vaikka ERK:iden raportoitiin mahdollisesti pystyvän fosforyloimaan STAT3:n Ser727:ssä (14). STAT3:n fosforylaatio voi kuitenkin tapahtua myös ERK:sta riippumattoman reitin kautta (15). Vaikka Ser727-fosforyloidun STAT3:n määrä väheni hieman 624mel-soluissa, BRAFV600E RNAi ei vaikuttanut DNA:n sitoutumisaktiivisuuteen (kuva 3 b) eikä STAT3-promoottoriaktiivisuuteen (kuva 3 c) (kuva 2). 888mel-soluissa Ser727-fosforylaatio väheni samalla tavoin, mutta päinvastoin sekä STAT3:n DNA-sitoutumisaktiivisuus (kuva 3 b) että STAT3-promoottorin aktiivisuus (kuva 3 c) vähenivät BRAFV600E RNAi:n jälkeen (kuva 2). Nämä tulokset viittaavat siihen, että STAT3:n transkription aktiivisuuden väheneminen ei ole tärkein mekanismi, joka synnyttää immunosuppressiivisten tekijöiden suppression MAPK-signaloinnin alaregulaatiolla näissä melanoomasolulinjoissa.
IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotannon estäminen A375-soluissa pelkän BRAFV600E:n, pelkän STAT3:n tai molempien RNAi:lla ilman, että STAT3:n DNA:n sitoutumis- ja promoottori-aktiivisuus muuttuisi merkittävästi. (a) IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotannon voimakas estäminen A375-soluissa pelkän BRAFV600E:n, pelkän STAT3:n tai molempien RNAi:n avulla. 5 tai 6 d infektion jälkeen sama määrä soluja annosteltiin tiheydellä 106 solua/2 ml, ja 18 tunnin kuluttua viljelyn supernatantista tehtiin ELISA IL-6:n, VEGF:n ja IL-10:n määrittämiseksi. BRAF:n ja fosforyloidun ERK1/2:n väheneminen BRAFV600E-spesifisellä RNAi:lla ja STAT3:n väheneminen STAT3-spesifisellä RNAi:lla vahvistettiin Western blot -analyysillä. Kuvassa on yksi edustava tulos kuudesta riippumattomasta kokeesta, joissa saatiin samankaltaisia tuloksia. (b) STAT3:n DNA-sitoutumisaktiivisuus ei muuttunut merkittävästi, kun MAPK-signalointia estettiin BRAF RNAi:lla melanoomasolulinjoissa. STAT3:n DNA-sitoutumisaktiivisuutta tutkittiin EMSA:lla melanoomasolulinjojen ydinuutteista, joissa oli joko kontrolli GL3B tai BRAF#1′ shRNA-vektorikäsittely. Nuolilla osoitetut spesifiset STAT3-nauhat hävisivät kylmällä villityyppisellä STAT3-DNA-koettimella (wt), mutta eivät mutantti STAT3-DNA-koettimella (mt). STAT3:n DNA-sitoutumisaktiivisuus väheni vain hieman 888mel-soluissa. (c) STAT3-reportterimääritykset A375-, 624mel- ja 888mel-soluissa. 2-4 × 105 solua, joissa oli joko kontrolli- tai BRAF#1′ shRNA-vektori-infektio, transfektoitiin 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc:lla ja 0,4 μg pRL-SV40:llä Effectene-transfektioreagenssilla. 24 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin ja analysoitiin firefly- ja renilla-luciferaasiaktiivisuuden osalta. Kukin tulikärpäslukiferaasiaktiivisuus normalisoitiin renilla-luciferaasiaktiivisuuteen. Tummennetut pylväät ja virhepylväät ilmaisevat kolminkertaisten määritysten keskiarvon ja keskihajonnan. Yksi edustava koe kolmesta tai neljästä riippumattomasta kokeesta on esitetty. STAT3-ohjattu transkriptio ei muuttunut BRAF RNAi:n jälkeen A375:ssä ja 624melissa, mutta se väheni hieman 888melissa.
Seuraavaksi tutkittiin A375-viljelmien supernatantissa olevien MAPK- ja STAT3-signalisaation indusoimien liukoisten tekijöiden aiheuttamia mahdollisia vaikutuksia DC:n kypsymiseen. Viljeltyjen A375-melanoomasolujen supernatantti sisältää liukoisia tekijöitä, jotka estävät ihmisen monosyyttiperäisen DC:n (MoDC) kypsymistä, kun sitä stimuloidaan Tollin kaltaisilla reseptoriligandeilla, kuten LPS:llä. A375-viljelmän supernatantin lisääminen MoDC-viljelmiin 10-20 prosentin loppupitoisuutena vähensi merkittävästi tulehdussytokiinien, kuten IL-12:n ja TNF-α:n, tuotantoa MoDC-soluissa sekä CD1a:n ja CD83:n solupintamolekyylejä, mutta ei CD80:n, CD86:n, CD40:n tai HLA-DR:n tuotantoa MoDC-soluissa. Kolmen muun melanoomasolulinjan supernatantit tuottivat samat tulokset, kun ne lisättiin MoDC-viljelmiin (ei kuvattu). Melanoomasolujen supernatanttien suppressiivinen aktiivisuus johtuu IL-6:n, IL-10:n ja VEGF:n tuotannosta, koska näiden tekijöiden spesifisten vasta-aineiden lisääminen vähensi A375-viljelmän supernatanttien suppressiivista aktiivisuutta (kuva 4 a). Eroavaisuudet havaintojemme ja aiemmin raportoitujen tulosten välillä, jotka koskevat hiiren B16-melanoomasolujen supernatanttia, jossa aktivoitunut STAT3 estää MHC-luokan II ja CD40:n ilmentymistä, voivat selittyä erilaisilla kasvainsoluilla tai lajeilla (8).
A375-melanooman viljelysupernatanttien suppressiivinen aktiivisuus väheni, kun niitä esikäsiteltiin pelkän BRAFV600E:n, pelkän STAT3:n tai molempien RNAi:lla LPS:n indusoiman IL-12:n ja TNF-α:n tuotantoon DC-soluista. (a) IL-6:n, IL-10:n tai VEGF:n neutralointi A375-melanoomasolujen kasvatusnesteissä palautti LPS-stimuloitujen ihmisen DC-solujen IL-12-tuotannon eston. Ihmisen MoDC-soluja viljeltiin A375:n supernatanttien kanssa IL-6:n, IL-10:n, VEGF:n monoklonaalisen vasta-aineen tai isotyyppikontrollivasta-aineen läsnäollessa tai puuttuessa 1 μg/ml. IL-12:n tuotanto viljelmien supernatanteissa määritettiin ELISA:lla 24 tuntia LPS-stimulaation jälkeen 100 ng/ml:n määrällä. (b) CD14+-monosyytit eristettiin PBMC-soluista MACS-menetelmällä ja niitä viljeltiin mediassa, joka sisälsi RPMI 1640:tä, 10 % (tilavuus/tilavuus) FBS:ää, 100 ng/ml GM-CSF:ää ja 50 ng/ml IL-4:ää sekä 20 % (tilavuus/tilavuus) kuvassa 3 valmistettujen A375mel-solujen kasvatusnesteen kanssa tai ilman sitä. (a) Puolet väliaineista, sytokiineista ja viljelmän supernatantista vaihdettiin 2 d:n välein. 5. viljelypäivänä lisättiin LPS:ää 100 ng/ml. Viljelysnesteet kerättiin 15 tunnin kuluttua ja niille tehtiin IL-12:n ja TNF-α:n ELISA-testi.
A375-viljelysnesteiden suppressiivinen aktiivisuus LPS:llä käsiteltyjen MoDC-solujen IL-12:n ja TNF-α:n tuotantoon saatiin palautettua esikäsittelemällä A375-soluja joko pelkkää BRAFV600E:tä, pelkkää STAT3:aa, STAT3:aa tai molempia, sekä BRAFV600E:aa että STAT3:aa, kohdentavilla rnai-kohteilla (Kuvio 4 b). Vaikka STAT3 RNAi näytti vähentävän A375-viljelmien suppressiivista aktiivisuutta enemmän kuin BRAFV600E RNAi, ero voi johtua yksinkertaisesti erilaisista RNAi-toiminnoista. On kuitenkin tärkeää huomata, että BRAF:iin ja STAT3:een samanaikaisesti kohdistuvalla RNAi:lla ei havaittu additiivisia ja synergistisiä vaikutuksia; tämä osoittaa jälleen kerran molempien signaalireittien olennaisen tärkeän roolin DC:n kypsymiseen vaikuttavien suppressiivisten tekijöiden tuotannossa. Vaikka STAT3:n dominoivan negatiivisen muodon kanssa transfektoidun hiiren CT26-paksusuolisyövän solulinjan supernatantin aiheuttama DC:n aktivoituminen mahdollisesti proinflammatoristen sytokiinien lisääntyneen tuotannon kautta on raportoitu, tässä tutkimuksessa ei havaittu DC:n aktivoitumista. Se saattaa selittyä BRAF:n ja STAT3:n epätäydellisellä inhibitiolla, sillä BRAF shRNA:lla transfektoiduissa melanoomasoluissa ei ollut lisääntynyttä proinflammatoristen sytokiinien tuotantoa tai kasvainsolujen tai -lajien eroavaisuuksilla.
Yhteenvetona olemme ensimmäistä kertaa osoittaneet, että MAPK-signalointi yhdessä STAT3-reitin kanssa näyttelee olennaista roolia erilaisten immunosuppressiivisten tekijöiden tuotannossa melanoomasolulinjoissa, joissa on konstitutiivisesti aktiivinen MAPK yleisen BRAFV600E-mutaation vuoksi. Siten MAPK-reitti voi olla potentiaalisesti merkittävä molekulaarinen kohde erilaisten syöpien immuunipuolustuksen voittamiseksi, koska se aktivoituu usein useissa syöpätyypeissä, myös melanoomissa, joissa ei esiinny BRAFV600E-mutaatiota (16, 17).