Abstract

TAUSTAA: Robertsonian translokaatioihin liittyy lisääntymisriskit, jotka riippuvat kyseessä olevista kromosomeista ja kantajan sukupuolesta. Kuvaamme viisi paria, jotka esiteltiin preimplantaatiodiagnostiikkaa (PGD) varten. MENETELMÄT: PGD suoritettiin käyttämällä alkion biopsiaa pilkkoutumisvaiheessa (3. päivä), fluoresenssi-in-situ-hybridisaatiota (FISH) lokusspesifisillä koettimilla ja alkion siirtoa 4. päivänä. TULOKSET: Pariskunta A:lla (45,XX,der(14;21)(q10;q10)) oli kaksi aiempaa raskautta, joista toisessa oli translokaatio trisomia 21. Onnistunut yksisikiöinen raskaus seurasi kahta PGD-sykliä. Pariskunta B:llä (45,XX,der(13;14)(q10;q10)) oli neljä keskenmenoa, joista kahdessa translokaatio-trisomia 14. Yksi PGD-sykli johti kolmosiin. Pariskunta C (45,XX,der(13;14)(q10;q10)) oli ollut neljä vuotta lapseton; kaksi sykliä epäonnistui. Pariskunta D (45,XY,der(13;14)(q10;q10)) sairasti oligozoosospermiaa. Kahden PGD-syklin jälkeen saatiin yksisikiöinen raskaus. Parin E (45,XY,der(13;14)(q10;q10)) siittiöiden määrä oli normaalialueella ja aneuploidisten siittiöiden määrä oli alhainen. PGD:tä ei sen vuoksi suositeltu. Mitään näyttöä kaoottisen tai mosaiikkimaisen kromosomikomplementin omaavien alkioiden suuresta esiintyvyydestä ei löytynyt. PÄÄTELMÄT: Hedelmällisille pariskunnille olisi tehtävä huolellinen riskinarviointi ja annettava geneettistä neuvontaa ennen PID:n harkitsemista. Jos translokaatioparit tarvitsevat avusteista hedelmöityshoitoa subfertiliteetin vuoksi, PID on arvokas seulonta epätasapainon varalta silloinkin, kun elinkelpoisen kromosomipoikkeavuuden riski on vähäinen.

Esittely

Robertsonin translokaatioita (kahden akrosentrisen kromosomin sentraalinen fuusioituminen) esiintyy yleispopulaatiossa esiintyvyydeltään ∼1:llä tuhannesta kromosomistosta (Gardner ja Sutherland, 1996). Ylivoimaisesti yleisimpiä ovat ei-homologiset muodot eli ne, joissa on mukana kaksi eri akrosentrista kromosomia – joko kaksi eri D-ryhmän kromosomia (kromosomit 13, 14 ja 15), kaksi eri G-ryhmän kromosomia (21 ja 22) tai yksi D-ryhmän ja yksi G-ryhmän kromosomi. Meioosissa nämä uudelleenjärjestelyt muodostavat trivalentteja, joiden segregaatio voi johtaa sukusoluihin, jotka ovat nollisomisia tai disomisia jommankumman uudelleenjärjestelyyn osallistuneen kromosomin osalta, ja näin ollen zygoottiin, jossa on trisomia tai monosomia jommankumman kromosomin osalta. Zygootit, joilla on monosomia, eivät ole yhteensopivia elämän kanssa, ja useimpien translokaatiotrisomia-käsiteiden odotetaan johtavan ensimmäisen raskauskolmanneksen menetykseen tai aikaisemmin; jotkut kuitenkin selviytyvät toisen raskauskolmanneksen jälkeen ja synnytykseen asti.

Yleisin Robertsonian translokaatio on kromosomien 13 ja 14 välillä. Tämä D/D-translokaatio muodostaa ~75 % kaikista Robertsonien kromosomeista (Gardner ja Sutherland, 1996). Mahdollinen elävänä syntyneen kromosomipoikkeavuuden lopputulos on translokaation trisomia 13 (Pataun oireyhtymä); empiirinen riski esiintymiselle toisen raskauskolmanneksen prenataalidiagnostiikassa on <0,4 % (Boué ja Gallano, 1984; Gardner ja Sutherland, 1996). Myös kromosomi 14:n uniparentaalinen disomia (UPD) on mahdollinen trisomian pelastamisen jälkeen, ja sen arvioitu riski on ~0,1-0,5 % (Gardner ja Sutherland, 1996). Translokaatiotrisomian 14 odotetaan johtavan ensimmäisen raskauskolmanneksen menetykseen. Der(13;14)-kantajilla keskenmenon kokonaisriskin ei odoteta poikkeavan merkittävästi 15 %:n taustariskistä (Harris ym., 1979) (enintään kaksi keskenmenoa); joillakin henkilöillä, joilla on der(13;14), esiintyy kuitenkin hedelmättömyyttä tai toistuvia spontaaneja abortteja. Muita D/D-Robertsoneita esiintyy paljon harvemmin, eikä erityisiä riskejä ole johdettu; der(13;15)- ja der(14;15)-tapauksilla voidaan kuitenkin olettaa olevan samanlainen riski kuin der(13;14)-tapauksella (Gardner ja Sutherland, 1996).

Yleisin Robertson-tapauksen jälkeinen Robertson-tapauksen tapainen tauti on der(14;21). Tämän D/G- Robertsonianin mahdollinen elävänä syntyvä epätasapainoinen lopputulos on translokaation trisomia 21, joka johtaa Downin oireyhtymään; naiskantajilla empiirinen riski esiintymiselle toisen raskauskolmanneksen prenataalidiagnoosin yhteydessä on 15 %, ja 10 %:lla on elävänä syntyvän trisomia 21:n riski ja lisäksi pieni riski UPD 14:n riskille, kuten aiemmin. Miespuolisilla kantajilla translokaation trisomia 21:n riski toisen raskauskolmanneksen aikana on <0,5 % (Boué ja Gallano, 1984; Gardner ja Sutherland, 1996), mikä johtuu mahdollisesti kromosomin 21 ylimääräistä homologia kantavien siittiöiden valikoivasta haitasta.

Muilla D/G-bertsonilaisilla translokaatioilla, jotka koskevat kromosomia 21, voidaan olettaa olevan samanlaiset lisääntymisriskit kuin der(14;21):llä; kromosomia 22 koskevilla translokaatioilla on pienempi riski, koska trisomia 22:lla on hyvin rajallinen potentiaali olla elinkelpoinen.

Prenataalidiagnostiikka on ollut Robertsonian translokaatioiden kantajilla käytettävissä jo vuosia. Raskauden keskeyttäminen translokaatiotrisomian tapauksessa ei kuitenkaan ole hyväksyttävä vaihtoehto joillekin pariskunnille, ja näiden translokaatioiden kantajien kohdalla kiinnostus istutusta edeltävään geneettiseen diagnostiikkaan (preimplantaatiodiagnostiikka, PGD) yhdessä avusteisen hedelmöityshoidon kanssa, jossa käytetään IVF:ää tai intrasytoplasmaattista siittiöiden injektiota (ICSI), on lisääntymässä.

PGD:tä tarjoaa nykyään noin 40 keskusta ympäri maailmaa, mukaan luettuna viisi keskusta Isossa-Britanniassa. Fluoresenssi-in-situ-hybridisaatiota (FISH) käytetään sukupuolen määrittämiseen X-sidoksissa (Handyside ja Delhanty, 1997; Kuo ym., 1998; Staessen ym., 1999; Pettigrew ym., 2000) ja sellaisten alkioiden tilan tutkimiseen, jotka ovat peräisin pariskunnista, joissa toisella kumppanilla on kromosomirelaatio. Kromosomirelaatioiden PGD aloitettiin kehittämällä kullekin vastavuoroiselle tai Robertsonian translokaatiolle erityisiä koettimia (Munné ym., 1998a), joiden avulla voitiin erottaa toisistaan normaalit alkiot ja alkiot, jotka kantavat translokaation tasapainoista muotoa. Yleisempi lähestymistapa vastavuoroisiin translokaatioihin tuli mahdolliseksi (Handyside ym., 1998; Scriven ym., 1998), kun kullekin kromosomille spesifiset subtelomeeriset koettimet kehitettiin (National Institutes of Health and Institute of Molecular Medicine Collaboration, 1996). Tämä lähestymistapa on johtanut onnistuneisiin raskauksiin vastavuoroisen translokaation kantajilla (Van Assche ym., 1999; Munné ym., 2000; Scriven ym., 2000), mutta sen avulla ei voida tehdä eroa “normaalien” ja “tasapainoisten” alkioiden välillä. Kromosomien uudelleenjärjestelyjen PGD:n raskaustiheydeksi on raportoitu 19 % alkionsiirtoa kohden (ESHRE PGD Consortium Steering Committee, 2000).

PGD:tä Robertsonian translokaatioiden varalta on tehty menestyksekkäästi useissa keskuksissa eri puolilla maailmaa sekä polaarikehon biopsialla että polaarikehon biopsialla (Munné ym., 2000), 1998a,b) kuin myös blastomeeribiopsialla, jossa alkiosta poistetaan yksi tai kaksi blastomeeria 6-10 solun vaiheessa (3. päivä hedelmöityksen jälkeen) (Escudero ym., 2000; Munné ym., 2000). Eräät keskukset ovat kuitenkin raportoineet korkeasta mosaiikisuuden ja kaaoksen määrästä Robertsonian translokaation kantajien alkioissa (Conn ym., 1998, 1999), mikä on johtanut heikentyneeseen raskauden onnistumisprosenttiin. Nämä havainnot ovat johtaneet ajatukseen, että Robertsonian translokaatiot saattavat jollakin tavalla altistaa malsegregaatiolle ja/tai normaalin alkionkehityksen puuttumiselle.

Me omassa keskuksessamme olemme arvioineet useita Robertsonian-pariskuntia, ja olemme tähän mennessä toteuttaneet neljälle pariskunnalle seitsemän sykliä, joiden tuloksena on syntynyt kolme raskautta ja neljä vauvaa. Tässä artikkelissa esitellään kokemuksemme Robertson-pareista, jotka ovat tutkineet PGD:n mahdollisuutta, ja yksityiskohtaiset tiedot toteutetuista sykleistä, mukaan lukien tiedot, jotka viittaavat siihen, että aiemmat raportit epänormaalien alkioiden suuresta määrästä näillä translokaation kantajilla voivat olla ainakin osittain keinotekoisia.

Materiaalit ja menetelmät

Karyotyypin määritys ja sytogeneettinen työ PGD:tä varten

Karyotyypin määritys G-nauhan metafaasikromosomianalyysillä viljellyistä perifeerisen veren lymfosyyteistä suoritettiin standarditekniikoita käyttäen. Metafaasi- ja interfaasiytimien FISH-tutkimuksissa käytettiin jäljempänä kuvattuja koetinyhdistelmiä ja menetelmää. Molemmat kumppanit arvioitiin sen varmistamiseksi, että koettimet hybridisoituivat odotetulla tavalla; kummastakin kumppanista tutkittiin 10 metafaasilevitystä ja 200 interfaasin ydintä pisteytettiin. Koettimien signaalimallit interfaasin ytimissä pisteytettiin käyttäen tavanomaisia pisteytyskriteerejä (Munné et al., 1998b). Koetinyhdistelmät arvioitiin kvalitatiivisesti signaalin hajanaisuuden ja kirkkauden suhteen, ja kvantitatiivisia tietoja käytettiin arvioimaan kunkin koettimen tehokkuutta itsenäisesti ja kunkin määrityksen spesifisyyttä. Kuten Yhdistyneessä kuningaskunnassa edellytetään, Human Fertilisation and Embryology Authoritylta (HFEA) hankittiin lupa PGD:n suorittamiseen kullekin eri koetinyhdistelmälle.

Sperman FISH-tutkimukset tehtiin kypsistä siittiöiden päistä, jotka oli dekondensoitu 10 mmol/l ditiotreitolilla (DTT) käyttäen jäljempänä kuvattuja koetinyhdistelmiä ja menetelmää.

Munasarjojen stimulaatio, alkionviljely ja biopsia

Näissä on noudatettu aiemmin kuvattuja menetelmiä (Scriven et al., 2000). Lyhyesti sanottuna luteaalivaiheen alenevaa säätelyä intranasaalisella gonadotropiinia vapauttavan hormonin agonistilla busereliiniasetaatilla (Suprefact; Hoechst) seurasi munasarjojen stimulaatio 225 i.u. vuorokaudessa rekombinantilla FSH:lla (Gonal-F, Serono). Ihmisen koriongonadotropiinia (HCG; Profasi, Serono) annettiin, kun vähintään kolmen follikkelin halkaisija oli >18 mm. Munasolujen talteenotto suoritettiin ultraääniohjatulla punktiolla 36 tuntia HCG:n antamisen jälkeen. Oosyytit ja alkiot kasvatettiin IVF-sekventiaalisessa mediassa (Science Scandinavia, Göteborg, Ruotsi) öljyn alla 5 % CO2:ssa ilmassa. Munasolujen keräämiseen ja yön yli tapahtuvaan hedelmöitykseen käytettiin IVF-mediaa. Normaalisti hedelmöittyneet alkiot siirrettiin G1.2-mikrotippoihin ensimmäisenä päivänä ja G2.2-mikrotippoihin toisena päivänä keskipäivällä yön yli tapahtuvaa viljelyä varten. Kolmantena päivänä suoritettiin alkion biopsia sen jälkeen, kun alkio oli purettu Ca/Mg-vapaassa Scandinavian Embryo Biopsy Medium -mediassa (Science Scandinavia) ja hapatetussa Tyroden liuoksessa zona-porausta varten. Blastomeerit arvioitiin tuman esiintymisen varalta ennen biopsiaa, ja kustakin alkiosta poistettiin yksi blastomeeri, jossa oli selvä tuma. Tämän jälkeen alkiot pestiin ja vaihdettiin G2.2-mikrotipoihin, kunnes alkiot siirrettiin seuraavana päivänä.

Blastomeerien interfaasitumien levittäminen

Jokainen yksittäinen blastomeeri siirrettiin 1-2 μl:n pisaraan 0,2-prosenttista Tween 20:aa 0,01N HCl-liuoksessa olevaan 0,01N HCl:n liuokseen, joka oli asetettuna silanisoidulle objektilasille. Blastomeeria tarkkailtiin stereomikroskoopilla levityksen aikana, jotta voitiin varmistaa, että tuma oli läsnä. Objektiolevyjen annettiin kuivua ilmassa ~20 minuuttia, pestiin PBS:ssä 5 minuuttia ja dehydratoitiin etanolisarjan kautta.

FISH

Biopsioidut blastomeerit hybridisoitiin koettimilla seuraavasti: (SpectrumOrange; Vysis, Inc., USA) ja biotinyloidulla 14q subtelomeerikoettimella (ei-kaupallinen); parit B, C ja D: parit B, C ja D: QuintEssential 13 (digoksigeniinileimattu, Appligene Oncor Lifescreen) ja TelVysion 14q (SpectrumOrange; Vysis Inc., USA). Kohdemateriaalia ja koetinta denaturoitiin yhdessä 75 °C:ssa 5 minuutin ajan ja hybridisoitiin sitten vähintään 14 tuntia 37 °C:ssa. Sitoutumattoman koettimen poistamiseksi suoritettiin tiukka pesu 2 × standardisuolaliuos-sitraattiliuoksessa (SSC) 70-72 °C:ssa 5 minuutin ajan. Biotinyloidut koettimet havaittiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC)-Avidiinilla (Vector Labs, Burlingame, CA); digoksigeniinillä leimattu koetin havaittiin FITC-anti-digoksigeniinillä (Boehringer Mannheim, UK). Valmisteet vastavärjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) / Vectashieldillä (Vector Labs) ja visualisoitiin Olympuksen fluoresenssimikroskoopilla, jossa oli 83 000 Pinkel-suodatin. Kuvat tuotettiin Quips-kuvausohjelmistolla (Vysis, UK).

Ei-siirretyt alkiot hajotettiin ja levitettiin 4. tai 5. päivänä, ja saadut tumat hybridisoitiin samoilla koettimien sekoituksilla kuin edellä.

FISH-tulosten luokittelu

FISH-virheprosentit laskettiin edellä kuvatulla tavalla. Biopsioidut solut luokiteltiin “normaaleiksi/tasapainoisiksi”, jos FISH osoitti selvästi kaksi signaalia kullekin testatulle kromosomille julkaistujen pisteytyskriteerien mukaisesti (Munné ym., 1998b). Kokonaisille alkioille annettiin “normaali/tasapainoinen” status, jos seuranta-FISH osoitti yhtenäistä “normaalia/tasapainoista” signaalikuviota FISH-määrityksen rajoitusten puitteissa (95 prosentin luottamusväli (CI) spesifisyydelle lymfosyyttityöskentelyn perusteella). Jos esimerkiksi FISH-määrityksen spesifisyys on 88 %, seuranta-alkio luokitellaan “normaaliksi/tasapainoiseksi”, jos enintään kolmella tuman 12:sta on poikkeava signaalikuvio, olettaen, että epänormaaleille signaalikuvioille ei ole mitään uskottavaa mekanismia (esimerkiksi selkeä osoitus toisesta solulinjasta), johon voitaisiin vedota.

Biopsiasoluille ja kokonaisille alkioille annettiin “epätasapainoinen” status, jos ytimissä oli selvä ja johdonmukainen poikkeama “normaalista/tasapainoisesta” signaalikuviosta.

Biopsiasoluille annettiin “epäselvä” status, jos signaalikuvio ei ollut selvästi normaali tulos, tavallisesti sen vuoksi, että kaksi signaalia oli lähekkäin toisiaan, mikä voitiin pisteyttää joko kahtena signaaleina tai yhdeksi ainoaksi “jakautuneeksi” signaaliksi. Kokonaisille alkioille annettiin “epäselvä” status, jos saatujen tuman laatu johti huonoon hybridisaatioon, mikä merkitsi sitä, että yksiselitteinen diagnoosi ei ollut mahdollinen.

Kokonaisille alkioille annettiin “mosaiikkinen” status, jos oli näyttöä kahdesta solulinjasta, joka perustui ≥2 tumaan kustakin solulinjasta.

Kokonaisille alkioille annettiin “kaoottinen” status, jos niiden tuman osuus (eli 95 %:n CI:n ulkopuolella, kuten edellä), joilla oli yhtenäinen scorable-signaalikuvio, oli riittämätön, jotta alkio voitiin luokitella johonkin muuhun kategoriaan.

Tulokset

Tapaus A:

39-vuotiaan naispuolisen kumppanin karyotyyppi oli 45,XX,der(14;21)(q10;q10)(q10;q10). Tällä pariskunnalla oli yksi fenotyyppisesti normaali lapsi (karyotyyppi ei tiedossa), ja edellisessä raskaudessa oli todettu translokaatio trisomia 21 (Downin syndrooma). Tämän pariskunnan FISH-tutkimus osoitti, että LSI 21 -luotaimen tehokkuus oli 97,4 % ja 14q-luotaimen 90,7 %. Testin spesifisyys oli 88,3 %. Kaksi PGD-sykliä suoritettiin.

Ensimmäisessä syklissä kerättiin 11 munasolua, joista seitsemän hedelmöittyi normaalisti, ja viisi alkiota biopsioitiin kolmantena päivänä. Näistä neljä antoi normaalin/tasapainoisen signaalikuvion biopsiassa, ja ne kolme, joilla oli paras morfologia päivänä 4, siirrettiin. Raskautta ei syntynyt. Viidennen alkion signaalikuvio oli +14, +21. Siirtämättä jääneet alkiot ja kaksi epänormaalisti hedelmöittynyttä alkiota levitettiin päivänä 4. Seuranta-FISH vahvisti diagnoosin ei-siirretyllä, normaalilla/tasapainoisella alkiolla, kun taas viides alkio osoitti kaoottista, triploidista komplementtia. Tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa I.

Toisen syklin aikana kerättiin 15 munasolua, 10 hedelmöittyi normaalisti ja yhdeksän alkiota biopsioitiin kolmantena päivänä. Näistä kolmessa näkyi normaali/tasapainoinen signaalikuvio; kaikki kolme siirrettiin, ja tuloksena oli yksisikiöinen raskaus. Pariskunta päätti ottaa 12 raskausviikolla korionkylvynäytteen, ja sikiöllä todettiin olevan translokaation tasapainoinen muoto: 45,XX,der(14;21)(q10;q10). Fenotyyppisesti normaali tyttö syntyi 38 raskausviikolla. Muista kuin siirretyistä alkioista biopsiadiagnoosissa todettiin yksi +21-, -21-, +14- ja -14-alkio sekä kaksi alkiota, jotka eivät olleet yksiselitteisiä. Alkion levittämisen jälkeinen seuranta-FISH vahvisti trisomia 21- ja monosomia 21 -diagnoosit, mutta kromosomin 14 osalta aneuploidiksi diagnosoitujen alkioiden jäljellä olevat ytimet vastasivat normaalia/tasapainoista kromosomikomplementtia. Lisäksi yksi alkioista, joiden biopsia-diagnoosi ei ollut yksiselitteinen, oli myös sopusoinnussa normaalin/epätasapainoisen kanssa, kun taas toinen alkioista oli degeneroitunut, ja levittämisen jälkeen löytyi vain yksi tuma, eikä diagnoosia saatu. Yksi epänormaalisti hedelmöittynyt alkio osoittautui mosaiikkitriploidiksi.

Tässä parissa, jossa diagnoosi oli mahdollista saada ja jossa epänormaalisti hedelmöittyneet alkiot oli suljettu pois, niiden alkioiden kokonaisprosenttiosuus, jotka vastasivat vuorottelevaa segregaatiota (normaali/tasapainoinen), oli 77 %, ja 15 % vastasi vierekkäistä segregaatiota (translokaation trisomia tai monosomia). Kaksi normaalista/tasapainoisesta alkiosta diagnosoitiin biopsiassa epätasapainoiseksi, mikä johtui todennäköisesti FISH-tekniikan virheestä. Nämä tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa I.

Tapaus B

34-vuotiaalla naispuolisella kumppanilla oli karyotyyppi 45,XX,der(13;14)(q10;q10), ja hänellä oli aiemmin ollut neljä keskenmenoa, joista kahdessa karyotyyppi oli määritetty ja todettu trisomia 14:ksi. FISH-tutkimus osoitti, että QuintEssential 13 -koettimen tehokkuus oli 97,2 % ja TelVysion 14q -koettimen 91,0 %. Testin spesifisyys oli 88,5 %. Yksi PGD-sykli suoritettiin.

Kymmenen munasolua kerättiin, joista kahdeksan hedelmöittyi normaalisti IVF:n avulla. Kahdeksan alkiota biopsioitiin kolmantena päivänä, joista viidellä oli normaali/tasapainoinen signaalikuvio (taulukko I). Näistä kolme siirrettiin, ja tuloksena oli kolmosraskaus, jonka jälkeen syntyi kaksi poikaa ja yksi tyttö, jotka kaikki olivat fenotyyppisesti normaaleja ja translokaation kantajia. Jäljelle jääneistä alkioista kaksi diagnosoitiin biopsiassa +13:ksi ja yksi +14:ksi. Trisomia 14 -diagnoosi ja yksi trisomia 13 -diagnoosi varmistuivat seurannassa; kolmannella poikkeavalla alkiolla todettiin kaoottinen kromosomikomplementti. Kaksi poikkeavasti hedelmöittynyttä alkiota levisi myös; toinen oli triploidi mosaiikki ja toinen haploidi.

Alkioista 63 % oli siis sopusoinnussa vuorottelevan segregaation kanssa ja 25 % sopusoinnussa vierekkäisen segregaation kanssa. Nämä tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti taulukossa I.

Tapaus C

37-vuotiaan naispuolisen kumppanin karyotyyppi oli 45,XX,der(13;14)(q10;q10). Raskautta ei ollut saavutettu neljän vuoden aikana ilman ehkäisyä. Kaksi PGD-sykliä suoritettiin.

Ensimmäisessä syklissä kerättiin kuusi munasolua, joista kaksi hedelmöittyi IVF:n avulla. Yksi alkio soveltui biopsiaan, ja se diagnosoitiin normaaliksi/tasapainoiseksi ja siirrettiin. Raskautta ei syntynyt. Yksi epänormaalisti hedelmöittynyt alkio levitettiin ja todettiin haploidiksi.

Toisessa syklissä kerättiin viisi munasolua, joista kaksi soveltui injektoitavaksi ICSI:n avulla. Molemmista saatiin biopsiakelpoisia alkioita, jotka diagnosoitiin normaaleiksi/epätasapainoisiksi ja siirrettiin. Raskautta ei syntynyt (ks. taulukko I).

Tapaus D

35-vuotiaan miespuolisen kumppanin (naispuolinen kumppani oli 34-vuotias) karyotyyppi oli 45,XY,der(13;14)(q10;q10), ja hänellä esiintyi oligozoosospermiaa (0,2-2×106/ml). Pariskunta ei ollut aiemmin saanut raskautta. Sperman FISH osoitti, että 14 % sukusoluista oli aneuploideja joko kromosomin 13 tai kromosomin 14 osalta. Kaksi PGD-sykliä suoritettiin.

Ensimmäisessä syklissä kerättiin viisi munasolua, joista neljä hedelmöittyi normaalisti ICSI:n jälkeen. Neljä alkiota biopsioitiin kolmantena päivänä; näistä kolme diagnosoitiin normaaleiksi/epätasapainoisiksi ja kaksi siirrettiin, mutta raskautta ei syntynyt. Kolmas normaali/tasapainossa oleva alkio levitettiin ja todettiin normaaliksi/tasapainossa olevaksi seurannassa. Neljäs alkio oli biopsiassa epäselvä, ja seurannassa todettiin, että sillä oli monosomia 14.

Toisessa syklissä kerättiin viisi munasolua, jotka kaikki hedelmöittyivät normaalisti ICSI:n jälkeen. Viidestä alkiosta otettiin biopsia kolmantena päivänä, joista kolme diagnosoitiin normaaleiksi/epätasapainoisiksi ja siirrettiin viitenä päivänä. Kahdesta siirtämättä jääneestä alkiosta toisen diagnoosi oli +13 ja toisen -14. Molemmissa tapauksissa seuranta ei kuitenkaan ollut yksiselitteistä. Alkioista 67 prosenttia oli siis translokaatiokromosomien osalta normaaleja/tasapainossa olevia kromosomeja. Tuloksena oli yksisikiöinen raskaus, ja pariskunta kieltäytyi prenataalidiagnostiikasta. Yksityiskohtainen sikiön poikkeavuustutkimus 20 raskausviikolla osoitti merkittäviä sikiön poikkeavuuksia, joihin kuuluivat mm. aivokurkiaisen ageneesi, hermostoputkivika ja ventraalisen väliseinän sydänvika. Sikiön karyotyypin todettiin olevan primaarinen trisomia 18 lapsivesipunktiossa. Tämä poikkeavuus ei todennäköisesti liittynyt translokaatioon, mutta interkromosomaalista vaikutusta ei voida sulkea pois (Blanco ym., 2000).

Tapaus E:

41-vuotiaan miespuolisen kumppanin (naispuolinen kumppani oli 37-vuotias) (karyotyyppi 45,XY,der(13;14)(q10;q10)) siittiöiden määrä oli normaalin rajoissa. Translokaatio oli ollut satunnaislöydös, eikä pariskunnan hedelmällisyyttä ollut selvitetty. Spermatutkimukset osoittivat, että 1,5 %:lla siittiöistä oli disomia 13 tai 14. PGD:tä ei suositeltu, koska pariskunnalla on suuri mahdollisuus saada aikaan elinkelpoinen, kromosomaalisesti normaali raskaus ilman PGD:tä.

Tulokset on esitetty yhteenvetona taulukoissa I ja II. Kuvassa 1 esitetään kaksi erilaista alkiobiopsiaa ja seurantatulokset.

Keskustelu

Tässä kuvatuista normaalisti hedelmöittyneistä alkioista 20 % oli seurausta translokaation epänormaalista segregaatiosta. Tämä on huomattavasti suurempi kuin teoreettiset riskit prenataalidiagnostiikassa, luultavasti siksi, että in vivo useimmat epänormaalit alkiot eivät onnistuisi synnyttämään raskautta. Robertsonian siirtymän epätasapainoisen tuotteen sisältävien alkioiden seulonnan ennen siirtoa odotettaisiin lisäävän onnistuneen raskauden mahdollisuutta. Koska kokonaisraskausluvut ovat PGD:n jälkeen samaa luokkaa kuin hedelmättömyyden vuoksi suoritetun IVF/ICSI:n jälkeen, PGD:tä voidaan pitää hyödyllisenä avusteisen hedelmöityshoidon lisänä pareille, joilla on Robertsonin translokaatioita ja joilla on myös hedelmällisyysongelmia. Tämä pätee riippumatta Robertsonien translaation luonteesta tai siihen liittyvistä empiirisistä lisääntymisriskeistä.

Neuvonta on kuitenkin tarpeen pareille, joiden hedelmällisyys on osoitettu. Toistuvat raskaudenkeskeytykset eivät välttämättä liity translokaatioon, varsinkaan 13;14 Robertson-translokaatioiden tapauksessa; tämä yhteys voidaan todeta vain karyotyypittämällä hedelmöitystuotteet, kuten edellä mainitussa tapauksessa B, jossa kahdessa neljästä keskenmenosta oli todettu trisomia 14. Jos PGD:tä pyydetään pariskunnille, joiden kohdalla yhteyttä ei ole todettu, olisi harkittava, onko tarkoituksenmukaista tehdä hedelmöityshoito hedelmöityskokeet hedelmöityskelpoiselle naiselle, kun translokaation merkitystä ei tiedetä. Muiden myötävaikuttavien tekijöiden, kuten fosfolipidivasta-oireyhtymän, mahdollisuus olisi tutkittava perusteellisesti, ja pariskuntaa olisi neuvottava sen mukaisesti.

Robertsonin translokaation 13;14 kantajien empiiriset lisääntymisriskit ovat vähäiset. Siittiöiden FISH-menetelmää, jossa käytetään translokaatiokromosomien koettimia, voidaan käyttää aneuploidiatason määrittämiseen, ja jos siittiöiden määrä on normaali ja aneuploiditaso alhainen, PGD:tä ei välttämättä tarvita, kuten tapauksessa E. Joillakin miehillä, joilla on oligozoosospermia ja Robertsonian translokaatio, kuten tapauksessa D, ICSI voi olla tarpeen lapsettomuuden voittamiseksi, jolloin PGD olisi hyödyllinen lisä, kuten edellä on käsitelty.

Robertsonian translokaation kantajilta peräisin olevissa alkioissa on raportoitu korkeaa mosaiikisuuden ja kaaoksen tasoa (Conn ym.), 1998, 1999). Nämä kirjoittajat havaitsivat, että vain 13 % testatuista alkioista oli normaaleja tai tasapainoisia translokaatiokromosomien osalta. Tässä raportoiduissa sykleissä, lukuun ottamatta epänormaalisti hedelmöittyneitä alkioita, 70 prosenttia alkioista oli normaaleja tai tasapainoisia translokaatiokromosomien suhteen. Vain kaksi alkiota (6 %) oli kaoottisia, ja todellista mosaiikillisuutta esiintyi vain poikkeavasti hedelmöittyneissä alkioissa (taulukko I). Joissakin alkioissa oli tetraploideja soluja, mikä osoitti karyokinesiksen ja/tai sytokinesiksen epäonnistumista näytteeksi otetussa solussa ja jota pidettiin normaalina havaintona. Näitä alkioita ei siksi luokiteltu mosaiikkisiksi. Tuloksemme poikkeavat julkaistusta luvusta, jonka mukaan 51 prosenttia alkioista luokiteltiin mosaiikkisiksi tai kaoottisiksi; nämä korkeat luvut saattavat johtua alkioiden viljelyolosuhteista (Scriven ym., 2000). Päätelmämme on, että Robertsonian translokaatiot eivät altista epänormaalille solunjakautumiselle pilkkoutumisvaiheen alkioissa, vaikka on edelleen mahdollista, että jotkin parit tuottavat suuren osuuden kromosomaalisesti epänormaaleja alkioita (Munné ym., 1996; Delhanty ym., 1996), 1997), mikä saattaa johtua puutteista solusyklin valvontamekanismeissa, jotka eivät liity mihinkään kromosomien uudelleenjärjestelyihin.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tämä artikkeli ei tue väitettä, jonka mukaan Robertsonianin translokaatiot altistavat alkioille, joilla on epänormaaleja jakautumisia. PGD:tä voidaan siis harkita, ja se on osoittautunut tehokkaaksi strategiaksi näiden kromosomirelaatioiden kantajille. Se, että yksi kuvatuista pareista ei onnistunut, johtuu todennäköisesti hedelmällisyysongelmista, jotka eivät liity translokaatioon. Toivomme, että tälle pariskunnalle voidaan saada aikaan onnistunut raskaus jossakin tulevassa raskaudenkierrossa. Kaikissa hedelmättömyystapauksissa PGD:tä voidaan pitää arvokkaana epätasapainon seulontana, vaikka elinkelpoisen kromosomipoikkeavuuden riski olisikin pieni. Näitä translokaatioita kantavien parien neuvonnassa olisi otettava huomioon parin ja perheen muiden kantajien aiempi synnytyshistoria sekä todetut riskiluvut keskenmenon ja kromosomipoikkeavuuden synnynnäisen riskin osalta; PGD ei välttämättä ole aina aiheellinen.

Tekijät haluavat kiittää Guy’s and St Thomas’ Centre for PGD:n muita jäseniä.