Abstract

Nanobioteknologian kehittymisen myötä kasvien välittämän hopean nanomateriaalien (AgNP) biosynteesin ympäristöystävällisistä lähestymistavoista on tullut houkuttelevampia biolääketieteellisiä sovelluksia varten. Tässä tutkimuksessa raportoidaan AgNP: iden biosynteesistä käyttäen Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) -kallusuutetta uutena pelkistävän aineen lähteenä. AgNO3-liuoksessa, joka haastettiin metanolisella kallusuutteella, väri muuttui keltaisesta ruskeaksi bioreduktioreaktion vuoksi. Lisäksi AgNP:t karakterisoitiin käyttämällä UV-violettispektrofotometriaa, röntgendiffraktiota (XRD), atomivoimamikroskopiaa (AFM) ja Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopiaa (FTIR). UV-vis-spektri paljasti AgNP:iden pintaplasmoniresonanssiominaisuuden noin 450 nm:ssä. XRD-kuvio, jossa oli tyypillisiä piikkejä, osoitti hopean kasvokeskittyneen kuutioluonteen. AFM-analyysi vahvisti pallonmuotoisten ja hyvin dispergoituneiden AgNP:iden olemassaolon, joiden keskimääräinen koko oli 52,0 nm. Lisäksi FTIR-analyysi vahvisti, että kallusuutteen eri fytokomponentit osallistuvat bioreduktioprosessiin nanohiukkasten muodostamiseksi. AgNP:t estivät tehokkaammin testattuja patogeenisiä mikrobeja, nimittäin Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, metisilliinille resistentti Escherichia coli, Staphylococcus aureus ja Candida albicans, kuin kallusuute. 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -määritys vahvisti AgNP:iden sytotoksisen ominaisuuden ihmisen paksusuolen adenokarsinooma-solulinjaa (HT-29) vastaan annosriippuvaisesti. Suuremmilla pitoisuuksilla (500 μg/ml AgNP:tä) solujen elinkelpoisuuden havaittiin olevan vain 7 % 24 tunnin kuluttua, kun IC50-arvo oli 254 μg/ml. Näin ollen nämä AgNP:t tukevat selvästi monipuolista potentiaalia, jota voidaan käyttää erilaisissa biolääketieteellisissä sovelluksissa lähitulevaisuudessa.

1. Johdanto

Nykyaikaisen maailman nousevana tieteenalana nanoteknologia on hyödyttänyt suuresti ihmisiä. Nanoteknologian tavoitteena on tuottaa ja hyödyntää nanokokoisia materiaaleja, joiden koko on 1-100 nm . Nanokokoisten materiaalien ainutlaatuiset ominaisuudet tekevät niistä houkuttelevampia sovellettaviksi eri aloilla, erityisesti lääkemolekyylien toimittamisessa, kuva-analyysissä, biomarkkerina, makromolekyylien tai taudinaiheuttajien biologisessa havaitsemisessa jne. Useita metallityyppejä käytetään nanomateriaalien synteesiin tiettyjä biolääketieteellisiä sovelluksia varten. Niitä ovat hopea (Ag), kulta (Au), titaanidioksidi (TiO2), sinkkioksidi (ZnO), kuparioksidi (CuO), magnesiumoksidi (MgO), kalsiumoksidi (CaO) ja piidioksidi (Si). Näillä nanorakenteilla on ainutlaatuisia fysikaalis-kemiallisia ja biologisia ominaisuuksia, kuten lujuus, plastisuus, kestävyys ja toiminnot. Näin ollen niitä käytetään laajalti eri aloilla, kuten elektroniikassa, biolääketieteessä ja biotekniikassa. Koska hopealla on antimikrobinen aktiivisuus, sitä on viime vuosina käytetty laajalti erilaisten antimikrobisten aineiden valmistuksessa. Nykyään hopeaa käytetään hopean nanohiukkasten (AgNP) syntetisoimiseksi erilaisiin sovelluksiin lääketieteen, elintarvikkeiden, terveydenhuollon jne. aloilla. Tämä johtuu siitä, että AgNP:illä, joilla on suurempi pinta-alan ja tilavuuden suhde, on ainutlaatuisia biologisia, sähköisiä, lämpö- ja optisia ominaisuuksia .

AgNP:ien syntetisoimiseksi on useita lähestymistapoja, mukaan lukien kemialliset, fysikaaliset ja biologiset menetelmät . Suositeltava menetelmä on kuitenkin käyttää biologista reittiä, jossa käytetään kasviyhdisteitä tai kasviuutteita, mikrobeja tai niiden tuotteita. Tämä johtuu pääasiassa turvallisuudesta, kustannustehokkuudesta ja ympäristöystävällisyydestä. Toisaalta kemialliset ja fysikaaliset menetelmät edellyttävät myrkyllisiä kemikaaleja, paljon energiaa, suurta painetta ja korkeaa lämpötilaa . AgNP:tä tuotettiin peräkkäin käyttämällä erilaisia kasviuutteita, kuten Leptadenia reticulata , Cassia didymobotrya , Andrographis paniculata , Prunus japonica , Talinum triangulare , Euphorbia antiquorum , Thymbra spicata ja Cleome viscosa . Viime aikoina AgNP:tä on syntetisoitu kasvin kalluksesta uutena lähteenä. Esimerkiksi Catharanthus roseus -kasvin, Sesuvium portulacastrum -kasvin, Taxus yunnanensis -kasvin, Centella asiatica -kasvin, Cucurbita maxima -kasvin jne. indusoimia kalluksia käytetään AgNP:iden biosynteesiin. Etuna on, että kallusviljelmät lieventävät luonnonvaraisten kasvilähteiden niukkuuteen liittyviä ongelmia. Lisäksi kallusuutteet tuottavat tehokkaammin erillisempiä ja hajanaisempia AgNP:itä kuin ne, jotka on biosyntetisoitu käyttämällä lehtiuutteita, joilla on korkeampi bioaktiivisuus .

Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) on arvostettu lääkekasvi, jolla on runsaasti bioaktiivisia komponentteja, kuten fenoleja, saponiineja, flavonoideja, alkaloideja, tanniineja, steroideja, triterpenoideja ja vitamiineja. Kasvi on tehokas kroonisen leukorrean, diabeteksen, niveltulehduksen, korkean verenpaineen ja viivästyneiden vaihdevuosien hoidossa. Safed musli -kasvin viljelyyn kentällä liittyvien ongelmien ratkaisemiseksi on otettu käyttöön kasvien kudosviljelymenetelmiä sen bioaktiivisten yhdisteiden saamiseksi. Charl et al. ovat aiemmin osoittaneet, että Safed musli -kallusviljely on luotettava kasvien sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden lähde. Lisäksi he ovat myös raportoineet Safed musli -kallusuutteen antimikrobisista ja antioksidanttisista vaikutuksista. Tähän mennessä ei kuitenkaan ole raportoitu AgNP:n biosynteesistä Safed musli -kasvin tai sen kalluksen avulla. Siksi tässä tutkimuksessa raportoidaan biologinen menetelmä AgNP:iden syntetisoimiseksi Safed musli -kallusuutteella niiden biologisten ominaisuuksien arvioimiseksi.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät

2.2. Materiaalit ja menetelmät Safed muslin kallusuutteiden valmistaminen

Safed muslin kallusviljelmien aloittamiseksi noudatettiin Nakasha et al. selostamaa menetelmää. Lyhyesti sanottuna Safed musli -lajin verson silmut inokuloitiin kiinteään Murashige ja Skoog -alustaan, joka sisälsi 5 mg/l 2,4-dikloorifenoksietikkahappoa, ja niitä kasvatettiin 4 viikkoa, minkä jälkeen ne korjattiin. Kallusuutteen valmistamiseksi 20 g tuorepainoista kallusta jauhettiin yhdessä 100 ml:n metanolin kanssa ja keitettiin noin 5 minuuttia. Uute suodatettiin Whatman nro 1 -suodatinpaperin avulla ja säilytettiin 4 °C:ssa. Uutetta käytettiin AgNP:n valmistukseen 1 viikon kuluessa.

2.2. Kokeet ja tutkimukset AgNP:iden biosynteesi

Noin 10 ml kallusuutetta haastettiin 90 ml:lla 1 mM AgNO3 (hopeanitraatti) -liuosta, joka oli Erlenmeyer-kolvissa (250 ml). Reaktioseosta pidettiin huoneenlämmössä ravistimella (150 rpm) ilman valoa. Värinmuutos kirjattiin säännöllisesti 5 tuntiin asti, ja AgNP:t säilytettiin huoneenlämmössä 3 kuukauden ajan vakauden tarkistamiseksi. Reaktioseos sentrifugoitiin 20 000 rpm:n kierrosluvulla 15 minuutin ajan biogeenisesti syntetisoitujen AgNP:iden konsentroimiseksi myöhempää karakterisointia varten.

2.3. Reaktioseoksessa käytettiin seuraavia menetelmiä. AgNP:iden karakterisointi

2.3.1. UV-Visibeli spektrianalyysi

Värinmuodostuksen muutosta reaktioseoksessa seurattiin visuaalisesti. Noin 2 ml liuosta kerättiin määräajoin 1, 3 ja 5 tunnin inkuboinnin jälkeen, ja hopeaionien pelkistyminen mitattiin 300-600 nm:n UV-näköspektrissä spektrofotometrillä (ELICO, Intia).

2.3.2. Spektrofotometri (ELICO, Intia). Röntgendiffraktioanalyysi (XRD)

Lasilevylle lisättiin ja päällystettiin yksi pisara AgNP-liuosta. Se analysoitiin myöhemmin biosyntetisoitujen nanohiukkasten kiteisen luonteen tallentamiseksi käyttämällä röntgendiffraktometriä (XRD), malli XRD-6000, Shimadzu, Japani, 40 kV:lla ja 30 mA:lla Cu ka -säteilyllä 2θ-enkelillä.

2.3.3. Röntgendiffraktometri. Atomivoimamikroskopia (AFM)

Käyttämällä AFM:ää (A.P.E. Research A100, Italia) AgNP:t karakterisoitiin niiden morfologisten ominaisuuksien tarkkailemiseksi. Aluksi AgNP:tä sisältävää liuosta sonikoitiin huoneenlämmössä 15 minuutin ajan ultraäänilaitteella. Myöhemmin AgNP-liuos kuivattiin muodostamaan ohut kerros kiillepohjaiselle lasilevylle, ja sitä käytettiin AFM:llä tapahtuvaan havainnointiin.

2.3.4. Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopian (FTIR) analyysi

Biogeenisesti syntetisoitujen AgNP:iden FTIR-analyysi suoritettiin käyttämällä Perkin Elmerin FTIR-spektriä käyttävää KBr-pellettiä käyttäen Shimazdu IR Prestige-21 FTIR-laitetta, jossa on diffuusi heijastustila (DRS-8000). Kaikki mittaukset suoritettiin alueella 400-4000 cm-1.

2.4. Antibakteerisen aktiivisuuden arviointi

Biosyntetisoitujen AgNP:iden antimikrobista aktiivisuutta arvioitiin levydiffuusiomenetelmällä tavallisia ihmisen patogeenisiä grampositiivisia bakteerikantoja vastaan, Bacillus subtilis B29 (ATCC 29737), metisilliinille resistentti Staphylococcus aureus (MRSA) (ATCC700698) (grampositiiviset), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) ja Escherichia coli E266 (gramnegatiiviset) sekä yhtä sienilajia, Candida albicans 90028. Kaikki mikrobikannat hankittiin UPM:n biotieteiden instituutin molekyylibiolääketieteen laboratoriosta, Serdang, Malesia. Kaikkia bakteerikantoja pidettiin Mueller-Hinton Agar (MHA) -alustalla, kun taas C. albicans 90028:ta viljeltiin perunadekstroosiagar (PDA) -alustalla. Antibakteeristen vaikutusten arvioimiseksi käytettiin levydiffuusiomenetelmää pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna kunkin mikrobin puhdas viljelmä pyyhittiin tasaisesti erillisille petrimaljoille käyttäen steriilejä pumpulipuikkoja. Viljelyalustaan asetettiin steriilejä kiekkoja (halkaisija 6 mm), jotka oli esipinnoitettu eri pitoisuuksilla (100, 200 ja 300 μg/ml) AgNP:tä ja metanolista lehtiuutetta. Dimetyylisulfoksidia (DMSO) (10 μg/μL) ja gentamysiiniä (10 μg/kiekko) käytettiin negatiivisena ja positiivisena kontrollina kaikkia testattuja mikrobeja vastaan. Kukin käsittely toistettiin 5 kertaa, ja koe toistettiin kahdesti. Kaikkia levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia, ja inhibitiovyöhykkeen esiintyminen (mm) kirjattiin viivottimen avulla.

2.5. Sytotoksisuuden arviointi paksusuolen syöpäsolulinjaa HT-29 vastaan

Arvioimme mykogeenisten AgNP:iden sytotoksista vaikutusta paksusuolen syöpäsolulinjaan HT-29, kuten aiemmin on raportoitu . Lyhyesti sanottuna soluja kasvatettiin Dulbecco’s Modified Eagle’s Mediumissa (DMEM), joka sisälsi penisilliiniä (100 U / ml), streptomysiiniä (100 g / ml), L-glutamiinia (2 mM) ja naudan sikiöseerumia (10 %). Noin 5 × 104 solua käytettiin inokulaatioon 96-kuoppalevyjen kuoppiin. Soluja inkuboitiin 37 °C:een säädetyssä CO2-inkubaattorissa 48 tunnin ajan. Sytotoksisuuden tutkimiseksi soluja käsiteltiin biosyntetisoidulla AgNP:llä (10, 20, 40, 80, 120 ja 160 μg/ml) ja inkuboitiin 48 tuntia solujen eloonjäävyyden arvioimiseksi 3-(4,5-dimetyylitatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsolibromiditestillä (MTT). Ensin valmistettiin tuore MTT-liuos (5 mg/ml) ja annosteltiin noin 10 ml sitä kuhunkin kuoppaan. Lisäksi sitä pidettiin inkubointia varten 4 tuntia samoissa olosuhteissa. Absorbanssi dokumentoitiin 570 nm:ssä monikuoppaisella ELISA-levylukijalla. Saatu absorbanssi muunnettiin solujen elinkelpoisuusprosentiksi käyttämällä alla olevaa kaavaa:

2.6. Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa ja toistettiin kolmesti. Kustakin kokeesta saadut tiedot esitettiin poikkeamana (SD).

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Kokeiden tulokset. Kalluksen muodostuminen ja AgNP:iden synteesi

AgNP:iden syntetisointi biologista reittiä pitkin on viime aikoina korostunut, koska biologinen menetelmä tuottaa vakaita ja yhtenäisiä AgNP:itä, joilla on ylivoimainen farmakologinen merkitys . Tässä tutkimuksessa käytettiin Safed musli callus -uutetta substraattina AgNP: iden syntetisoimiseksi huoneenlämmössä. Tässä tutkimuksessa korjattiin 2 kuukauden kuluttua muodostuneet keltaisen väriset murenevat kallukset (kuva 1).

Kuva 1

Näyttää kalluksen muodostumisen MS-mediumilla, jota oli täydennetty 2,4-D:llä (5 mg/l) 2 kuukauden kuluttua.

Safed musli callia pidetään tässä vaiheessa kypsänä ja hyvin kehittyneenä erittämään kasvin sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita. Näin ollen AgNP:iden syntetisointiprosessissa käytettiin 2 kuukauden kuluttua korjattuja calleja. Yleisesti ottaen nanohiukkasten tuotanto ja ominaisuudet vaihtelevat kasvilajin liuotinuutteissa esiintyvien bioaktiivisten yhdisteiden mukaan. Kun AgNO3-liuos haastettiin Safed muslin metanolisen kallusuutteen kanssa, väri muuttui keltaisesta vaaleanruskeaksi bioreduktioreaktion vuoksi (kuva 2). Tämä viittaa selvästi AgNP:iden biosynteesiin, joka korreloi AgNP:iden pintaplasmoniresonanssivärähtelyjen herättämiseen. Värimuutos havaittiin välittömästi tunnin kuluessa, ja värin voimakkuus kasvoi inkubointiajan kasvaessa 5 tuntiin asti. Yli 5 tunnin inkubointi ei kuitenkaan osoittanut havaittavaa värin muutosta. Värin voimakkuus kasvoi vähitellen inkubaatioajan kasvaessa ja pysyi korkeimmillaan 5 tunnin inkubaation jälkeen. AgNP:iden biosynteesiin kasviuutteista liittyviä täsmällisiä mekanismeja ei toistaiseksi tunneta selvästi. On kuitenkin ehdotettu joitakin mahdollisia mekanismeja, jotka voivat olla mukana biosynteesissä. Näin ollen solujen entsyymit sekä kasviuutteissa esiintyvät erilaiset kasviyhdisteiden luokat, kuten fenolit, flavonoidit, fytosterolit, terpenoidit, orgaaniset hapot, alkaloidit ja alkoholit, saattaisivat tehokkaasti vähentää AgNP:iden muodostumista hopeaioneista. Aiemmin tutkijat ovat raportoineet, että inkubaation kesto hopeaionien bioreduktioon AgNP:ien muodostamiseksi vaihtelee kasvilajeittain johtuen eroista kasviuutteiden fytokomponenttien esiintymisessä kasviuutteissa .

Kuva 2

Safed musli -kallusuutteen keltainen väri (A); AgNO3-liuoksen läpinäkyvä väri (B) ja reaktioseoksen ruskea väri AgNO3:lle altistamisen jälkeen 48 tuntia, mikä osoittaa AgNP:iden muodostumista (C).

3.2. AgNP:iden karakterisointi

3.2.1. UV-viisumispektroskopia-analyysi

UV-viisumispektroskopian, XRD:n, AFM:n ja FTIR-analyysin avulla saatiin kallusuutteesta valmistettujen AgNP:iden kokoon, muotoon, dispersioon ja pinta-alaan liittyviä tietoja. UV-spektri osoitti jyrkän absorptiohuipun esiintymisen noin 450 nm:ssä, mikä viittaa AgNP:iden esiintymiseen (kuva 3). Aiempien raporttien mukaan UV-säteilyn absorptiokaista 425-460 nm:n välillä osoittaa AgNP:iden pintaplasmoniresonanssia (SPR). Tämä SPR-piikki yhdessä kallusuutteen bioreduktiivisten aineiden kanssa voi mahdollisesti osallistua AgNP:iden muodostamiseen ja vakauttamiseen. Leveän piikin esiintyminen voisi korreloida pallomuotoisten AgNP:iden polydispersiiviseen luonteeseen .

Kuva 3

UV-viisivärinäköisyysabsorptiospektroskopia, jossa näkyy AgNP:iden ominainen SPR-piikki.

3.2.2. XRD-analyysi

XRD-analyysin diffraktiohuippujen havainnointi antaa yksityiskohtaisia tietoja biosyntetisoitujen AgNP:iden kiteisestä luonteesta ja kemiallisesta koostumuksesta. Safed musli callus -uutteella syntetisoitujen AgNP:iden XRD-kuvion tulos on esitetty kuvassa 4. Diffraktiointensiteetit 20°:sta 70°:iin kirjattiin. Havaitut piikit, joiden 2θ on 38,34°, 44,54° ja 64,6°, vastaavat hopean kasvokeskisen kuutiorakenteen (111), (200) ja (220) tasoja. Nämä tulokset ovat samankaltaisia kuin Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS no. 04-0783). Myös muut havaitut pienet piikit saattavat korreloida AgNP:n pinnalle adsorboituneiden kiteisten orgaanisten yhdisteiden kanssa. Samankaltaisia diffraktiokuvioita havaittiin myös aiemmissa havainnoissa, jotka liittyivät kasvilähteistä syntetisoituihin AgNP:iin .

Kuva 4

XRD-kuvio biosyntetisoiduista AgNP:istä, joissa käytettiin Safed musli -kasvin kallusuutetta. AFM-analyysi

AFM-analyysi suoritettiin Safed muslin kallusuutteesta biosyntetisoitujen AgNP:iden topologisten ominaisuuksien tallentamiseksi. Tulos paljasti selvästi, että pallomaiset AgNP:t ovat tasaisesti hajallaan (kuva 5). AgNP:iden koko vaihteli 35,1 ja 168,0 nm:n välillä, ja niiden keskimääräinen koko oli 52,0 nm. Biosyntetisoitujen AgNP:iden karheus oli 7,9 nm ja karheuden neliöllinen keskiarvo 14,6 nm (kuvat 5(a) ja 5(b)). Nämä havainnot vahvistavat aiemmin raportoidut nanorakenteiset ja pallomaiset AgNP:t, jotka on biosyntetisoitu eri kasvilajeista, kuten Leptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa ja Coptidis rhizoma .

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 5

AFM-kuvat Safed muslin kallusuutteella biosyntetisoiduista AgNP:istä.

3.2.4. FTIR-analyysi

Safed musli -kallusuutteessa esiintyvien biosyntetisoitujen AgNP:iden ja eri kasviyhdisteiden todennäköinen vuorovaikutus määritettiin FTIR-analyysillä. Näiden fytokomponenttien uskotaan toimivan pelkistävinä ja stabiloivina aineina niiden AgNP-biosynteesin aikana . Kuvassa 6 esitetään biosyntetisoitujen AgNP:iden FTIR-spektritiedot, joissa on 14 erillistä piikkiä 4000-500 cm-1 -alueella. Laaja piikki 3437,86 cm-1:ssä vastaa -O-H- ja -N-H-ryhmien venytysvärähtelyjä. Samoin piikki 2920,59 cm-1:ssä johtuu -C-H-ryhmistä. Kaistat 1623,72 cm-1 ja 1376 cm-1 saattavat johtua C=C-ryhmien venytysvärähtelyistä ja C-N-kaltaisten amiini- tai C-O-kaltaisten fenoliryhmien läsnäolosta. Aaltoluku 1382,41 voitaisiin osoittaa -CH2-ryhmälle. Piikki 1019,38 johtuu C=O-ryhmien venytyksestä. Kolme heikkoa kaistaa 828,4, 671,13 ja 615,95 cm-1 vastaavat -O-H- ja C-H-ryhmien taivutusvärähtelyjä. Aikaisemmat tutkijat tekivät samanlaisia havaintoja muista kasvipohjaisista AgNP:istä. Lisäksi nämä absorptiohuiput voivat liittyä Safed muslin kallusuutteessa oleviin lukuisiin fytokemiallisiin yhdisteisiin. Tämän tueksi Charl et al. on aiemmassa tutkimuksessaan vahvistanut erilaisten fytokomponenttien esiintymisen kaasukromatografia-massaspektrometria-analyysin avulla. Kaiken kaikkiaan FTIR-tiedot osoittavat Safed musli -kallusuutteen monikäyttöisyyden bioreduktioprosessissa sekä AgNP:iden stabiloinnissa.

Kuva 6

FFTIR-spektritiedot Safed muslin kallusuutteella tuotetuista AgNP:istä.

3.3.2.3. KUVA 6. Kallusuutteen tuottamat AgNP:t. Antibakteerisen aktiivisuuden arviointi

AgNP:illä on laajakirjoinen antimikrobinen aktiivisuus, ja siksi niitä käytetään laajasti kliinisissä sovelluksissa . Niiden käyttö mikrobilääkkeinä on kuitenkin tehokasta, ja niitä voidaan soveltaa vasta sen jälkeen, kun niiden haittavaikutuksiin liittyvät ongelmat on ratkaistu . Näin ollen arvioimme Safed musli -kallusuutteesta biosyntetisoitujen AgNP: iden antimikrobisia vaikutuksia ihmisen patogeenejä vastaan. Havaittiin, että AgNP:t estivät tehokkaasti kaikkia testattuja bakteerikantoja annosriippuvaisesti (taulukko 1). Mielenkiintoista oli, että AgNP:llä oli suurempi inhibitiovyöhyke kuin kallusuutteella. AgNP:iden suurin inhibitio havaittiin C. albicansia vastaan ( mm), jota seurasivat B. subtilis ( mm) ja E. coli ( mm) 300 μg/ml:n pitoisuudella. AgNP:t estivät kuitenkin kaikki mikrobit 300 μg/ml:n pitoisuudella. Suurin inhiboiva aktiivisuus havaittiin B. subtilis -bakteeria () vastaan, jota seurasivat C. albicans () ja E. coli () AgNP:ien 300 mg/ml pitoisuudella. Aiemmin tutkijat ovat ehdottaneet muutamia mahdollisia kasvipohjaisten AgNP:iden antimikrobisen vaikutuksen mekanismeja. Sen mukaan AgNP:t denaturoivat mikrobien soluseinää, horjuttavat ulkokalvoa, estävät soluhengitystä, estävät biosynteesiä ja häiritsevät protonien liikkeellepanovoimaa. Myös AgNP:iden suurempi pinta-alan ja tilavuuden suhde on vastuussa antimikrobisesta aktiivisuudesta. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat selvästi, että Safed musli -kallusuutteesta syntetisoituja AgNP:tä voitaisiin käyttää antibakteerisina aineina monien ihmisten sairauksien hoitoon.

Konsentraatio (μg/ml) Inhibitiovyöhyke (mm) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Candida albicans B29 (MRSA) ATCC 15442 E266 90028 Kallusuute Kallusuute 100 200 300 AgNPs 100 . 200 300

Kokeessa oli mukana negatiivisena kontrollina DMSO (20 μL), kun taas streptomysiini (100 mg/ml) bakteereille ja nystatiini (100 mg/ml) hiivalle toimivat positiivisena kontrollina. Kukin arvo edustaa poikkeamaa (SD) 3 toistosta käsittelyä kohti 3 toistetussa kokeessa. Huomautus: “-” tarkoittaa, että aktiivisuutta ei ole havaittu, kun taas “MR” tarkoittaa metisilliinille resistenttiä.

Taulukko 1

Safed musli callus -uutteen ja siitä biosyntetisoitujen AgNP:iden antimikrobiset aktiivisuudet ihmisen patogeenejä vastaan.

3.4. Mikrobiologiset vaikutukset. AgNP:t syöpäsoluja vastaan

Lisäksi AgNP:iden aktiivisuus syöpäsolulinja HT-29:ää vastaan tutkittiin MTT-määrityksellä. Tutkimuksen tulokset on esitetty kuvassa 7. Solujen elinkelpoisuuden prosenttiosuus väheni AgNP:iden pitoisuuksien kasvaessa 0-500 μg/ml. Se viittaa ilmeisesti siihen, että AgNP:illä on annosriippuvainen solunestovaikutus. Lisäksi altistusajan pidentäminen 24 tunnista 48 tuntiin vähensi solujen elinkelpoisuusprosenttia. 24 tunnin kuluttua kontrollikäsittelyissä solujen elinkelpoisuus oli 100 %, kun taas 500 μg/ml AgNP:tä käytettäessä vain 7 % soluista säilyi hengissä, mikä väheni edelleen 2 %:iin 72 tunnin inkubaatioajan jälkeen. Tämä merkitsee AgNP:iden voimakasta myrkyllisyysvaikutusta. Vaikka biosyntetisoitujen AgNP:iden myrkyllisyys on vähäisempää pienemmillä annoksilla, ne aiheuttavat erittäin suuren tappavan vaikutuksen suuremmilla annoksilla. Vastaavasti aiemmat tutkijat ovat dokumentoineet kasvipohjaisten AgNP:iden mahdollisen soluja estävän vaikutuksen annosriippuvaisesti. AgNP:ien IC50-arvon laskettiin olevan 254, 216 ja 174 μg/ml 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin käsittelyn jälkeen.

Kuva 7

Biosyntetisoitujen AgNP:ien sytotoksisuustulokset Safed musli -kasvin kallusuutteella.

Aiemmassa raportissa on todettu, että Safed musli -kallusuutteessa on useita eri luokkia fytokemikaaleja . Siten kasviyhdisteiden reaktiiviset funktionaaliset ryhmät, kuten hydroksyyli-, karboksyyli- ja aminoryhmät, yhdistyvät hopeaionien kanssa osoittaakseen suurempaa sytotoksisuutta. Samoin on osoitettu, että hopeaionit yhdessä reaktiivisten funktionaalisten ryhmien kanssa ovat voimakkaassa vuorovaikutuksessa soluarkkitehtuurin kanssa aiheuttaen soluvaurioita .

Lisäksi hopeaioneilla on voimakas affiniteetti välttämättömien entsyymien sulfhydryyliryhmiin ja fosforia sisältäviin emäksiin. Näin ollen AgNP:t vuorovaikuttavat tehokkaasti nukleiinihappojen kanssa ja aiheuttavat DNA-vaurioita häiritsemällä mitokondrioiden hengitysketjua, edistämällä reaktiivisten happilajien muodostumista, estämällä DNA:n replikaatiota ja solun jakautumista, edistämällä apoptoosia jne. Lisäksi AgNP:iden muut ominaisuudet, kuten nanoregime-luonne, pallomainen muoto ja hiukkasten pinta, vaikuttavat myös osaltaan syöpää ehkäiseviin ominaisuuksiin. Vastaavasti on raportoitu, että erilaisten irtotavaramateriaalien avulla valmistettujen nanomateriaalien solunestovaikutus paksusuolen syöpäsoluja vastaan on selvitetty. Erityisesti syövänvastainen aktiivisuus johtui pääasiassa kasviuutteiden kemiallisesta koostumuksesta ja nanohiukkasten ominaisuuksista, mukaan lukien AgNP:iden koko ja morfologiset ominaisuudet .

4. Johtopäätökset

Johtopäätös

Johtopäätöksinä voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa kuvataan tehokasta, kustannustehokasta ja ympäristöä säästävää toimintatapaa, jonka avulla voidaan biosyntetisoida AgNP:itä Safed musli -kallusuutteen avulla. Biovalmistetuilla AgNP:illä on pallomainen muoto, ja niiden hiukkaskoko vaihtelee 35,1 ja 168,0 nm välillä. XRD-kuvio osoitti, että AgNP:t esiintyvät nanokiteiden muodossa, kun taas AFM-havainto vahvisti AgNP:iden pallomaisen muodon. FTIR-spektri paljasti fytokemikaalien esiintymisen kallusuutteissa, ja niiden katsotaan osallistuvan AgNP:iden biosynteesiin ja stabilointiin. Lisäksi biosyntetisoitujen AgNP:iden antimikrobisen ja syövänvastaisen aktiivisuuden osoittaminen viittaa siihen, että niitä voitaisiin hyödyntää nanolääkkeiden valmistuksessa terapeuttisiin sovelluksiin, kuten mikrobilääkkeisiin ja paksusuolen syöpien hoitoon. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot tukevat selvästi näiden kasviperäisten AgNP:iden monipuolista potentiaalia.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen havaintojen tukena käytetyt tiedot sisältyvät artikkeliin.

Erityisintressiristiriidat

Tekijät ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemiseen liittyen ole eturistiriitoja.

Erityisintressiristiriidat

Kirjoittajat ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemisella ole merkitystä.