3.1 Kalojen endogeeniset entsyymit
Kuten edellä on käsitelty, kalojen sisäelimissä, ruoansulatuskanavassa ja lihaskudoksessa on erilaisia proteolyyttisiä entsyymejä.
Sardellin tärkeimmät endogeeniset proteinaasit olivat trypsiinin kaltainen proteinaasi, pepsiini, kymotrypsiini, elastaasi ja aminopeptidaasi (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Trypsiinin, kymotrypsiinin ja pepsiinin ruoansulatusentsyymejä pidetään kolmea tärkeämpää entsyymiä kuin muita (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). Pepsiiniä esiintyy yleensä kalojen mahassa, ja se on ruoansulatusmehujen tärkein entsyymi (de la Parra ym., 2007). Kalojen ja äyriäisten ruoansulatuselinten hepatopankreas sisältää sekä peptidaasi- että proteinaasiaktiviteetteja, kuten aminopeptidaasia, gelatinolyyttisiä proteaaseja, trypsiiniä ja kymotrypsiiniä sekä kollagenolyyttisiä proteaaseja (Sriket, 2014).
Havaittiin, että peda-käsittelyn yhteydessä suurin osa lipolyysi- ja proteolyysiaktiviteeteista kirjattiin suolistossa erityisesti käymisprosessin alkuvaiheessa; aktiviteetit kuitenkin laskivat nopeasti prosessin aikana (Irianto, 1990). Kun otetaan huomioon, että entsyymejä esiintyy sisäelimissä ja ruoansulatuskanavassa, sisälmysten poistamisella on tärkeä rooli entsymaattisen hajoamisen nopeuden ja tyypin määrittämisessä. Kokonaisista kaloista valmistetuilla fermentoiduilla kalatuotteilla on erilaiset ominaisuudet kuin kaloilla, joiden päät on poistettu ja joista on poistettu sisälmykset (Wheaton & Lawson, 1985). Useimpien kalojen sisäelinten ja ruoansulatuskanavan entsyymien entsymaattinen aktiivisuus oli suurinta lähes neutraaleissa pH-arvoissa (Bougatef ym., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño ja Toro (2004) eristivät sardiinien sisäelimistä happoproteolyyttisen entsyymin, joka kuuluu asparagiiniproteaasiluokkaan. Entsyymi on samankaltainen kuin muiden kalalajien pepsiini II, ja se on stabiili pH:ssa 3-6 ja 45 °C:ssa.
Pyloruscaeca edustaa elimiä, jotka ovat tärkein emäksisten proteinaasien lähde. Turskan (G. morhua) pyloruscaecaecasta saadun trypsiinin kaltaisen entsyymin isoelektrinen piste oli 5,30 ja 5,89, ja se oli aminohappokoostumukseltaan hyvin samankaltainen kuin naudan trypsiini, mutta erosi siitä siinä, että siinä oli suurempi suhteellinen määrä happamia aminohappoja ja pienempi määrä emäksisiä aminohappoja. Entsyymi hydrolysoi myös kalaproteiinisubstraatteja (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Sardiinista eristettiin kolme emäksistä ja kaksi hapanta proteinaasia. Kukin emäksisistä proteinaaseista hydrolysoi kaseiinia nopeammin kuin muita proteiineja. Tärkein emäksinen proteinaasi (III) hydrolysoi sardiinin sarkoplasmisia proteiineja viisi kertaa nopeammin kuin muut emäksiset proteinaasit. Kumpikin kahdesta happoproteinaasista hydrolysoi hemoglobiinia ja myoglobiinia nopeammin kuin muut proteiinit. Kun alkaliproteinaasi (III) ja happoproteinaasi (II) oli esi-inkuboitu 25-prosenttisella NaCl:lla, ne olivat stabiileja, vaikka muut proteinaasit muuttuivat epävakaiksi. Nämä kaksi proteinaasia, emäksinen proteinaasi III ja hapan proteinaasi II, olivat stabiileja myös 3 kuukauden ajan kalakastikkeen valmistuksen aloittamisen jälkeen. Kunkin emäksisen ja happaman proteinaasin proteolyyttinen aktiivisuus inhiboitui voimakkaasti yli 15 % NaCl:n vaikutuksesta; inhibitio oli kuitenkin vähäisintä, kun substraattina käytettiin sardiinilihasproteiineja (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Kaksi aminopeptidaasia (I ja II) uutettiin sardiinin rasvattomista sisäelimistä ja puhdistettiin käyttäen DEAE-selluloosakromatografiaa, geelisuodatusta Sephadex G-200:lla ja isoelektristä fokusointia. Entsyymien I ja II lopulliset valmisteet arvioitiin lähes homogeenisiksi polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Entsyymien I ja II molekyylipainot määritettiin geelisuodatuksella vastaavasti 370 000:ksi ja 320 000:ksi. Isoelektriset pisteet olivat 4,1 (I) ja 4,8 (II). EDTA inhiboi molemmat entsyymit ja Co++ aktivoi ne. Bestatiini pystyi inhiboimaan entsyymiä I mutta ei entsyymiä II. Entsyymit I ja II hydrolysoivat nopeasti paitsi alaniinia tai leusiinia sisältäviä synteettisiä substraatteja myös di-, tri- ja tetra-alaniinia. Kaikkien näiden ominaisuuksien perusteella sardiinin aminopeptidaasit muistuttavat ihmisen alaniiniaminopeptidaasia. Entsyymi I säilytti yli 70 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan 15 %:n NaCl:ssa, mikä viittaa siihen, että entsyymi osallistuu kalan proteiinien ja peptidien hydrolysointiin kalakastikkeen valmistuksen aikana (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Emäksisten ja happamien proteinaasien aktiivisuutta verrattiin naudan trypsiiniin ja pepsiiniin ja osoitettiin, että naudan trypsiinin tavoin sardiinien pyloric caeca:sta peräisin oleva emäksinen proteinaasi hydrolysoi kaseiinia tehokkaammin kuin muita proteiinisubstraatteja (Noda et al., 1982).
Lihakudoksen entsyymit, erityisesti kathepsiinit, peptidaasit, transaminaasit, amidaasit, aminohappodekarboksylaasit, glutamiinidehydrogenaasit ja niihin liittyvät entsyymit, löytyvät kaikki kalan lihaskudoksesta (Chaveesuk, 1991), ja nämä entsyymit, erityisesti trypsiini, kymotrypsiini ja kathepsiini, osallistuvat proteiinien hydrolyysiin kalakastikkeen fermentaation aikana (Fernandes, 2016). Lihaskudoksen entsyymit sijaitsevat enimmäkseen soluissa. Toisaalta ruoansulatusentsyymit ovat eksosellulaarista eritystä. Vaikka jotkin tutkimukset osoittivat, että lihaskudoksen entsyymien optimaalinen aktiivisuus on neutraalissa pH:ssa, useimmissa raporteissa kerrotaan, että matalat pH-arvot kiihdyttävät lihaskudoksen entsyymiaktiivisuutta. Useimmat fermentoidut kalatuotteet käsitellään pH:n ollessa yli 4, lukuun ottamatta kalasäilörehua ja joitakin fermentoituja kalatuotteita. Näin ollen useimmat lihaskudoksen entsyymit eivät itse asiassa ole optimaalisessa pH-olosuhteessa (Mackie et al., 1971).
Hevosmakrillin lihaksesta saatujen B-katekpsiinien osittainen karakterisointi osoitti samankaltaisia piirteitä muiden B-katekpsiinien kanssa. Kathepsiinin optimaalinen pH oli 5 ja optimaalinen lämpötila 50 °C. Aktiivisuutta inhiboivat E-64, CA-074 ja kymostatiini (Yoshida ym., 2015).
Maksimaalinen entsyymiaktiivisuus voidaan saavuttaa käyttämällä kokonaisia kaloja, mukaan lukien päät ja sisäelimet. Sitä vastoin entsyymiaktiivisuus on minimaalinen, kun fermentoitujen kalatuotteiden valmistukseen käytetään päätöntä ja perattua kalaa. Samaan aikaan keskinkertainen entsyymiaktiivisuus voidaan saavuttaa poistamalla sisälmykset milloin tahansa kalan pyydystämisen jälkeen, jotta sisäelinten entsyymit diffundoituisivat kudoksiin (Owens & Mendoza, 1985).
Suolatussa kalassa kypsymistä kuvataan kolmella hypoteesilla. Nämä ovat (1) mikrobiologinen teoria, (2) autolyyttinen teoria ja (3) entsyymiteoria. Mikrobiologisessa teoriassa mikro-organismit tuottavat välttämättömiä aktiivisia entsyymejä, ja nämä entsyymit tunkeutuvat lihaan ja edistävät kypsymisprosessia. Autolyyttisen teorian mukaan kypsyminen on seurausta lihasten tai muiden kudosten tai ruoansulatuskanavan entsyymien toiminnasta. Lopuksi entsyymiteoria selittää suolatun kalan kypsymisen tapahtuvan tiettyjen entsyymien vaikutuksesta, nimittäin lihaskudoksen sisältämien entsyymien, kalan suolistoelinten sisältämien entsyymien sekä mikro-organismien tuottamien entsyymien vaikutuksesta (Mackie et al., 1971).
Sardellien kypsyttämisessä intialaisen anjoviksen (Stolephorus indicus) autolyyttinen aktiivisuus oli suurimmillaan 60 °C:ssa. Autolyyttinen aktiivisuus väheni NaCl-pitoisuuden kasvaessa. Raakauutteen optimaalinen pH oli 8,5-9,5. Trypsiinin kaltaiset proteinaasit olivat vallitsevia proteinaaseja raakauutteessa. Intian sardellin proteinaasit voivat osallistua proteiinien hydrolyysiin kalakastikkeen käymisen aikana. Siksi intialaisen sardellin inkubointi 60 °C:ssa ja 10 %:n NaCl:ssä jonkin aikaa ennen täydellistä suolausta 25 %:n NaCl:ssä voisi olla tehokas tapa nopeuttaa kalakastikkeen käymisprosessia (Siringan et al., 2006).