Abstract

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia uudenlaisella Lactobacillus casei HD-010:lla fermentoidun sipuliuutteen (Allium cepa L.) antihyperlipidemisiä ja antioksidatiivisia mahdollisuuksia. Fermentoitua sipuliuutetta käytetään yleensä sen antioksidatiivisen aktiivisuuden (ORAC), adiposyyttien erilaistumista estävän vaikutuksen, kversetiinipitoisuuden ja antihyperlipidemisten vaikutusten vuoksi. Fermentoidun sipuliuutteen vaikutusta hyperlipidemiaan oraalisen annostelun jälkeen ApoE-puutteisilla hiirillä ei kuitenkaan ole vielä raportoitu. Ymmärtääksemme fermentoidun sipuliuutteen vaikutusta hyperlipidemiaan käytimme tässä tutkimuksessa positiivisena kontrollina bentsafibraattia (10 mg/kg, paino/vrk). Seerumi kerättiin viikoittain matalan tiheyden lipoproteiinien (LDL), korkean tiheyden lipoproteiinien (HDL), triglyseridien (TG) ja kolesterolin, 3-hydroksi-3-metyyligutaryi-CoA:n (HMG-CoA) reduktaasiaktiivisuuden ja kolesteroliesterin kuljetusproteiinin (CETP) aktiivisuuden analysoimiseksi. Fermentoidulla sipulilla käsitellyssä ryhmässä HDL-taso nousi merkittävästi, kun taas TG- ja LDL-tasot laskivat merkittävästi kontrolliryhmän tasoihin verrattuna. Lisäksi HMG-CoA-reduktaasin estoaktiivisuus lisääntyi 20 % fermentoidulla sipulilla käsitellyssä ryhmässä 100 mg/kg. CETP-aktiivisuuden havaittiin olevan merkittävästi estynyt fermentoidulla sipulilla käsitellyissä ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tulokset viittaavat siihen, että fermentoidulla sipulilla on ennaltaehkäisevä/terapeuttinen vaikutus hyperlipidemiaan. Sillä saattaa olla potentiaalia kehitettäväksi funktionaalisena elintarvikkeena.

1. Johdanto

Viime aikoina ruoan kulutustottumukset ovat muuttuneet huomattavasti perinteisestä fermentoituihin elintarvikkeisiin perustuvasta saannista (Kimchi, fermentoidut soijapavut jne.) rasvaa sisältävään länsimaalaistuneeseen ruokavalioon (liha, rasvat jne.) Aasiassa, Korea mukaan lukien . Länsimaistuneen ruokavalion tiedetään lisäävän lihavuuden, korkean verenpaineen, diabeteksen ja hyperlipidemian riskejä. Hyperlipidemia on sydän- ja verisuonitautien riskitekijä. Hyperkolesterolemian hallinta on tärkeää hyperlipidemian ehkäisemiseksi. Triglyseridipitoisuuden alentaminen verenkierrossa on yksi sydän- ja verisuonitauteihin liittyvien potilaiden hoidoista indusoimalla LDL-reseptoreita ja rajoittamalla VLDL:n eritystä tietyillä lääkkeillä .

Hyperlipidemian oireiden vähentämiseen on olemassa useita lääkkeitä, kuten HMG-CoA:n reduktaasin estäjä (statiineja), PPAR-alfa-aktivaattori (fibraatti), CETP:n estäjä, sappihappojen sekvestrantit ja ACAT:n estäjä . Näiden lääkkeiden pitkäaikaishoidolla on kuitenkin sivuvaikutuksia. Niinpä monissa tutkimuksissa on pyritty lisäämään lääkkeiden tehoa .

Veren kolesterolipitoisuuden vähentäminen on tärkeä tutkimuskysymys funktionaalisten elintarvikkeiden ja lääkkeiden kehittämisessä sydän- ja verisuonisairauksien riskin vähentämiseksi. Kasveista tai organismeista peräisin olevat luonnolliset komponentit ovat potentiaalisia ehdokkaita sairauksien puhkeamisriskin vähentämiseksi. Sipulia (Allium cepa L.) on käytetty veren kolesterolipitoisuuden alentamiseen. Aasiassa sitä on perinteisesti käytetty lääkkeenä sen kuumetta alentavien, parasiitteja ehkäisevien, myrkkyjä poistavien ja suolistotulehduksia ehkäisevien vaikutusten vuoksi. Sipulin tärkeimmät yhdisteet ovat flavonoideja (kversetiini, kversitriini ja rutiini) ja rikkiyhdisteitä (allyylipropyylidisulfidi, diallyylidisulfidi), joilla on terveyttä parantavia vaikutuksia . Toinen tapa vähentää kolesterolia on käyttää Lactobacillusta käymiseen. Lactobacillus on tutkittu sen kolesterolia vähentävän vaikutuksen vuoksi. Klaver et al. ovat raportoineet, että Lactobacillus voi dekonjugoida sappihappoa ja estää kolesterolin toimintaa. Fermentoidun sipuliuutteen vaikutusta hyperlipidemiaan oraalisen annostelun jälkeen ApoE-puutteisilla hiirillä ei kuitenkaan ole vielä raportoitu. Tämän vuoksi tässä tutkimuksessa keskityttiin fermentoidun sipulin (Allium cepa L.) ja uuden Lactobacillus casei HD-010 -uutteen (Lactobacillus casei HD-010) antihyperlipidemiallisiin ja antioksidatiivisiin mahdollisuuksiin lipidimetaboliassa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Materiaalit ja menetelmät. Bakteerikannan ja viljelyolosuhteiden valinta

Kymmenen kantaa tunnistettiin fermentoidusta sipulista, ja tärkein kanta oli Lactobacillus casei HD-010 (taulukko 1). Positiivisena kontrollina käytimme Korean Collection for Type Cultures -kokoelmasta peräisin olevaa L. casei KCTC 2180 -bakteeria. Tunnistettua L. casei HD-010 -kantaa kasvatettiin 30 °C:ssa 10 päivän ajan sipuliuutteen fermentoimiseksi. Sipuliuute valmistettiin jauhetusta puhtaasta sipulista sen jälkeen, kun se oli pesty kolmesti kaksoistislatulla vedellä. Käymiseen käytettiin sipuliuutetta, joka oli autoklavoitu 121 °C:ssa 15 minuutin ajan. Kannan tunnistusalusta valmistettiin käyttämällä 5,5-prosenttista MRS-lientä (Difco, Ranska) ja 2,0-prosenttista agaria (Difco, Ranska). Nestemäinen elatusaine valmistettiin kantojen tunnistusaineeksi ilman 2,0 % agaria.001

2.2. Fermentoidun sipuliuutteen valmistus

Sipuliuutteen fermentointiin käytettiin 30 litran fermentointilaitetta (Biostat C Plus, Sartorius, Ruotsi), jossa käytettiin 100-prosenttista sipuliuutetta steriileissä olosuhteissa. Sipuliuutteen jäähdyttämisen jälkeen 1 % HD-010, jota inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelemalla (200 rpm) 24 tuntia, inokuloitiin fermentoriin ja kasvatettiin 37 °C:ssa ravistelemalla (25 rpm) 10 päivän ajan. Kun fermentoitu sipuliuute oli suodatettu suodattimella (huokoskoko 0,2 μm), uute lyofilisoitiin (PVTFD20RS, Ilshin Lab. Co. Ltd., Korea) ja säilytettiin -80 °C:ssa kokeen suorittamiseen asti. Positiivisena kontrollina käytettiin L. casei KCTC 2180 -uutetta. Se valmistettiin samalla menetelmällä kuin L. casei HD-010.

2.3. Happiradikaalisen absorptiokapasiteetin määritys (ORAC)

Käyneiden sipulien, orgaanisten liuottimien kerrosten, fraktioiden ja alifraktioiden antioksidanttikapasiteetit määritettiin ORAC-määrityksellä Gillespie et al. kuvaamalla tavalla. Lyhyesti sanottuna näytteet tai trolox (0, 6,25, 12,5, 25, 50 ja 100 μg/ml) sekoitettiin fosfaattipuskuroituun keittosuolaliuokseen (75 mmol/l, pH 7,4, Thermofisher scientific, Waltham, MA, USA). Sen jälkeen 96-kuoppalevyn kuoppiin lisättiin β-phykoterytriiniä (0,2 mmol/l) ja 2,2′-atsobis(2-amidinopropaani)dihydrokloridia (AAPH, 200 mmol/l, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japani) radikaaligeneraattoreina. Fluoresenssi mitattiin fluoresenssi-ELISA-lukulaitteella (VICTOR®, PerkinElmer, Yhdysvallat) kahden minuutin välein 60 minuutin ajan (heräteaallonpituus: 535 nm, emissioaallonpituus: 590 nm). AUC:n (area under the curve) saamiseksi käytetty yhtälö oli seuraava:

jossa f0 oli fluoresenssin alkulukema 0 minuutin kohdalla ja fi oli fluoresenssin lukema i:n (1-60) minuutin kohdalla.

2.4. AUC:n (area under the curve) saamiseksi käytetty yhtälö oli seuraava. Adiposyyttisolujen viljely ja erilaistuminen

Ostimme 3T3-L1-solulinjoja American Type Culture Collectionista (ATCC, Yhdysvallat). 3T3-L1-preadiposyyttisolut istutettiin 96-kuoppalevyihin tiheydellä 1 × 104 solua kuoppaa kohti. Ja kasvatettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa Dulbeco’s Modified Eagle Media (DMEM, Gibco, Invitrogen, USA) -mediassa, jota täydennettiin 10 %:lla vastasyntyneen vasikan seerumilla (Gibco, Invitrogen, USA) ja 100 U/ml penisilliini-streptomysiinillä (Gibco, Invitrogen, USA). Seuraavaksi 3T3-L1-preadiposyyttisoluja kasvatettiin erilaistumisväliaineessa (MDI), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FBS, Gibco), 10 μg/ml insuliinia (Sigma-Aldrich), 0,5 mM 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinia (IBMX, Sigma-Aldrich) ja 1 μM deksametasonia (Sigma-Aldrich). Kaksi päivää erilaistumista indusoivalla aineella (MDI, joka sisälsi 0,5 mM IBMX:ää, 1 μM deksametasonia ja 10 μg/ml insuliinia) stimuloinnin jälkeen väliaine vaihdettiin DMEM:ään, joka sisälsi 10 % FBS:ää ja 10 μg/ml insuliinia. Kaksi päivää myöhemmin väliaine vaihdettiin jälleen 10 % FBS/DMEM:ään. Soluja kasvatettiin 10 % FBS/DMEM:ssä kahden päivän välein. Täydellinen erilaistuminen saavutettiin päivään 8 mennessä. Sipuliuutenäytteitä lisättiin 3T3-L1-soluviljelmiin eri pitoisuuksina (6,25 ~ 100 μg/ml) neljänä päivänä erilaistumisinduktion jälkeen.

Intrasellulaarinen lipidipitoisuus mitattiin 96-kuoppalevyillä käyttäen AdipoRed ™ -määritysreagenssia (Cambrex, MA, USA). Päivänä 8 hoitoväliaine poistettiin ja solut kiinnitettiin 4-prosenttiseen formaldehydiliuokseen huoneenlämmössä (25 °C) 5 tunnin ajan. Kun solut oli huuhdeltu PBS:llä, jokaiseen kuoppaan lisättiin 200 μl PBS:ää ja 5 μl AdipoRed-reagenssia. Kun levyjä oli inkuboitu huoneenlämmössä 10 minuuttia, ne mitattiin fluoresenssi-ELISA-lukulaitteella (VICTOR®, PerkinElmer, USA) heräteaallonpituudella 485 nm ja emissioaallonpituudella 535 nm. Kunkin ryhmän arvoja käytettiin laskettaessa 50 prosentin tehokasta estopitoisuutta (EC50) adiposyyttien erilaistumisen vähentämiseksi. Positiivisina kontrolleina käytettiin bentsafibraattia ja simvastatiinia.

2.5. L. casei HD-010

L. casei HD-010:lla fermentoidun sipuliuutteen erottelu ja fraktiointi Pakastekuivatut fermentoidut sipuliuutteet resuspendoitiin tislattuun veteen ja partitioitiin neljällä eri orgaanisella liuottimella (n-heksaanilla, CH2Cl2:lla, etyyliasetaatilla ja n-butanolilla) ja jäännös H2O:lla. Nämä jakeet rikastettiin dekompressiolla ja pakkaskuivattiin jäljellä olevan liuottimen poistamiseksi. CH2Cl2-kerrokset levitettiin peräkkäin HP-20-, silikageeli- ja RP-C18-avokolonnikromatografiaan samoissa kolonniolosuhteissa (3,8 x 60 cm, 300 g) aktiivisen yhdisteen saamiseksi L. casei HD-010:lla (LFAc) fermentoiduista sipuleista

2.6. Kversetiinipitoisuudet

Kversetiinipitoisuudet fermentoiduissa sipuliuutteissa analysoitiin kvantitatiivisesti analyyttisellä HPLC:llä (Shimadzu CBM-20A Network LC-järjestelmä, jossa on LC-6AD-pumppu, SPD-M20APDA-detektori, joka on varustettu SIL-10AF-sarjan automaattisella nestenäytteenottimella). Eclipse Plus-C18-kolonnia (Agilent, 3,0 x 100 mm, 0,35 μm) käytettiin seuraavissa olosuhteissa: virtausnopeus 1,0 ml/min, kokonaisajon pituus 30 minuuttia, liikkuva faasi 90 % ACN plus 0,02 M KH2PO4 (pH 2,0 H3PO4:n kanssa), näytteiden tai STD:n injektiotilavuus 20 μl ja aallonpituus 372 nm. Vertailevana johdannaisstandardina käytettiin kversetiiniä (Q4951) (CAS-numero 117-39-5, Sigma-Aldrich, USA)

2.7. Eläinkokeet

Urospuoliset ApoE-puutteiset hiiret (viiden viikon ikäiset) toimitettiin Central Laboratory Animal Inc:ltä Koreasta ja ne säilytettiin 23 ± 0,5 ° C: ssa, 55 ± 7 %: n kosteudessa ja valo-pimeä-syklissä (12 tuntia : 12 tuntia). Kaikki eläimet totutettiin vähintään viikon ajan. Ne olivat häkissä, ja niitä ruokittiin vähärasvaisella, vähäkolesterolisella kontrolliruokavaliolla D12336 (Central Laboratory Animal Inc., Soul, Korea).

Kaikki eläinkokeet suoritettiin taudinaiheuttajista vapaalla suojavyöhykkeellä Kyungpookin kansallisessa yliopistossa. Kyungpookin kansallisen yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitea hyväksyi kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt menettelyt (IACUC-hyväksyntänumero: KNU2012-136).

Kontrolliryhmää ruokittiin runsasrasvaisella ruokavaliolla. Positiivinen kontrolliryhmä ruokittiin bentsafibraatilla (10 mg/kg). Fermentoitua sipuliuutetta syötettiin kolmelle ryhmälle eri määriä suun kautta 0,5 ml:aan suolaliuosta (pieni annos, 25 mg/kg; keskisuuri annos, 50 mg/kg; ja suuri annos, 100 mg/kg). Negatiivisena kontrollina käytettiin pelkkää suolaliuosta sisältävää ryhmää (N=10/ryhmä). Tämän tutkimuksen eläinkokeen rakenne on esitetty kuvassa 1.

Kuva 1

Eläinkokeen rakenne. Lipidipitoisuuksien mittaus

Hiiriltä kerättiin verta retroorbitaalisen sinusverenvuodon menetelmällä intraorbitaalisen laskimopleksin avulla viikoittain kuuden viikon ajan. Verinäytteitä inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuuttia ja sentrifugoitiin 600 g:llä 10 minuuttia 4 °C:ssa. Verinäytteet valmistettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa määritykseen asti. HMG-CoA-reduktaasin ja CETP:n estoaktiivisuus mitattiin viimeisessä koepisteessä kerätyistä seeruminäytteistä ( viikon näytteet). HMG-CoA-reduktaasin ja CETP:n estoaktiivisuus mitattiin HMG-CoA-reduktaasin määrityssarjalla (Sigma, USA) ja CETP:n määrityssarjalla (Biovision, USA). Seerumista mitattiin kokonaiskolesterolin (TC), LDL-kolesterolin (LDL-C), HDL-kolesterolin (HDL-C) ja triglyseridien (TG) pitoisuudet käyttäen Asan-kittiä (Asan medical company, Korea) ja Beckman Coulterin biokemiallista analysaattoria.

2.8. Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± keskihajonta (keskiarvo ± SD). Tietojen tilastolliset analyysit määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä, jossa käytettiin kaksihaaraista t-testiä.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Fermentoidulla sipulilla on antioksidatiivista aktiivisuutta

Olemme tutkineet L. casei HD-010:lla (LFAc) fermentoidun sipuliuutteen antioksidatiivista aktiivisuutta ORAC-määrityksellä. LFAc:lla oli korkeampi ORAC-arvo kuin positiivisella kontrollilla Troloxilla (LFAc-uutteen ORAC-arvo = 1,02).

Määrittääksemme, mitkä L. casei HD-010:lla fermentoidun sipuliuutteen fraktiot sisälsivät antioksidatiivisia ainesosia, erottelimme uutetta edelleen neljällä eri orgaanisella liuottimella, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät -osiossa. LFAc-EtOAc-fraktioilla oli korkein ORAC-arvo (ORAC of LFAc-EtOAc = 1,12) (kuva 2), mikä viittaa siihen, että L. casei HD-010:lla fermentoidun sipuliuutteen EtOAc-fraktiot (LFAc) sisälsivät antioksidatiivisen komponentin. Tämä tulos viittaa siihen, että L, casei HD-010:lla (LFAc) fermentoidulla sipuliuutteella on antioksidatiivista aktiivisuutta.

Kuva 2

L, caseiHD-010:lla (LFAc) fermentoidusta sipuliuutteesta orgaanisilla liuottimilla saatujen fraktioiden antioksidatiivinen aktiivisuus. Hapen radikaalisen absorptiokapasiteetin (ORACPE) arvot saatiin antioksidanttimäärityksessä käyttäen eri orgaanisia liuotinfraktioita. Troloxia käytettiin positiivisena kontrollina (ORAC-arvo oli 1,00). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (n = 3). #p<0.05 verrattuna kontrolliryhmään (FO-käsitelty ryhmä); ##p<0.05 verrattuna kontrolliryhmään (AO-käsitelty ryhmä); ###p<0.05 verrattuna LFAc-käsiteltyyn ryhmään; p<0.05 verrattuna positiiviseen kontrolliryhmään (L. casei KCTC 2180 käsitelty ryhmä); p<0.05 verrattuna positiiviseen kontrolliin (troloxilla käsitelty ryhmä); FO, tuore sipuli; AO, autoklaavisipuli; LFAc, fermentoitu sipuli L. casei HD-010; Hx, n-heksaani; CH2Cl2, dikloorimetaani; EtOAc, etyyliasetaatti; BuOH, n-butanoli; L. casei KCTC 2180, L. casei KCTC 2180:llä fermentoitu sipuli.

3.2. Adiposyyttien erilaistumisen esto

Käynyt sipuli, jossa on L. casei HD-010 (LFAc), vaikutti adiposyyttien erilaistumista estävästi verrattuna tuoreeseen sipuliin tai autoklavoituun sipuliin (> 20 %). LFAc:n inhiboiva vaikutus havaittiin erityisesti CH2Cl2-kerroksessa (> 45 %) (kuva 3). Positiivisena kontrollina bentsafibraatilla ei ollut vaikutusta erilaistumiseen. Simvastatiinikäsittely osoitti kuitenkin yli 90 %:n erilaistumisen estoa. Näin ollen LFAc:lla on inhiboiva tehtävä estämällä HMG-CoA-reduktaasiaktiivisuutta.

Kuva 3

L. casei HD-010:lla fermentoidun (L. casei HD-010:lla (LFAc) fermentoidun sipuliuutteen (Allium cepa L.) adiposyytti- eli rasvasolujen erilaistumisen esto. Tiedot on esitetty keskiarvoina ± SD (n = 3). p<0,05 verrattuna FO-, AO-, LFAc- tai LFAc-Hx-käsiteltyyn ryhmään; #p<0,05 verrattuna positiiviseen kontrolliin (bentsafibraattikäsitelty ryhmä); ##p<0,01 verrattuna positiiviseen kontrolliin (bentsafibraattikäsitelty ryhmä). FO, tuore sipuli; AO, autoklaavisipuli; LFAc, fermentoitu sipuli L. casei HD-010:lla; Hx, n-heksaani; CH2Cl2, dikloorimetaani; EtOAc, etyyliasetaatti; BuOH, n-butanoli. L. casei HD-010:lla fermentoidun sipuliuutteen dikloorimetaanikerroksilla (LFAc) on sekä adiposyyttien erilaistumista estäviä että antioksidatiivisia vaikutuksia

Fysiologisen aktiivisuuden indusoimiseksi LFAc:ssä olevan aktiivisen yhdisteen puhdistamiseksi ja tunnistamiseksi CH2Cl2-kerrokset tehtiin useilla eristysmenetelmillä (HP-20, silikageeli ja RP-C18-avokolonni). HLFAc-30- ja SLFAc-4-fraktiot, joilla oli voimakas adiposyyttien erilaistumista estävä vaikutus, saatiin peräkkäin (päivämäärää ei ole esitetty) sen jälkeen, kun SLFAc-4-fraktiot oli edelleen eristetty RP-C18-avoimessa kolonnissa.

Hyperlipidemiaa estävän toiminnon tutkimiseksi LFAc:n jälkeen MC-fraktio käsiteltiin HP-20-, piigeeli- ja RP-18-avokromatografialla. Antioksidanttisia ja adiposyyttien erilaistumista estäviä vaikutuksia havaittiin LFAc-HP3-fraktiolla HP-20:sta, LFAc-S4-fraktiolla silikageelistä ja LFAc-C3:lla C1:stä (taulukko 2).

Näytteet Inhib. (EC50 = μg/ml) ORAC LFAc_CH2Cl2 53.25 1.10 ± 0.015 LFAc_C1 53.41 1.06 ± 0.028 LFAc_C2 56.56 1.04 ± 0.013 LFAc_C3 40.25 1.15 ± 0.021 LFAc_C4 42.98 1.16 ± 0.057 LFAc_C5 >100 ND Trolox ND 1.00 ± 0.017

Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (n = 3); p<0.05 verrattuna kontrolliryhmään (PBS-käsitelty ryhmä); p<0.05 verrattuna positiiviseen kontrolliin (Troloxilla käsitelty ryhmä). ND (ei havaittu).

Taulukko 2

Adiposyyttien erilaistumisen esto ja antioksidatiiviset aktiivisuudet LFAc_S4:stä valmistettujen alifraktioiden osalta C18-avokolonnia käyttäen.

3.4. Kversetiinipitoisuus

Ohutkerroskromatografiaa (TLC) käytettiin komponenttien erottamiseen raa’asta sipuliuutteesta (FO), steriloidusta sipuliuutteesta (AO) ja fermentoidusta sipuliuutteesta (LFAc). Kuvio ei eronnut näytteiden välillä, ja näytteistä löytyi neljä pääpilkkua (tietoja ei ole esitetty). LFAc-C4-fraktiolla oli paras adiposyyttien erilaistumista estävä vaikutus, ja tehokas yksittäinen fraktio tunnistettiin. Kversetiini, yksi sipulin tärkeimmistä ainesosista, tunnistettiin LFAc-C4-fraktiosta. FO, AO, LFAc ja LFAc_CH2Cl2 tutkittiin HPLC:llä. Kversetiinipitoisuudet näissä fraktioissa olivat FO, 3,90 ± 0,041 mg/ml; AO, 7,13 ± 0,009 mg/ml; LFAc, 2,89 ± 0,064 mg/ml; ja LFAc_CH2Cl2, 20,53 ± 0,304 mg/ml. Fermentointimenettely ei muuttanut kversetiinipitoisuutta. Kuitenkin probioottien kanssa tapahtuneen fermentoinnin jälkeen kversetiinipitoisuus kasvoi lähes kymmenkertaiseksi LFAc-CH2Cl2:ssa (kuva 4).

Kuva 4

Kvartsetiinipitoisuuksien kvantitatiivinen määrä sipuliuutteessa (Allium cepa L.) fermentoinnilla tai ilman fermentointia HPLC-analyysin avulla. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3). FO, tuore sipuli; AO, autoklaavisipuli; LFAc, fermentoitu sipuli L. casei HD-010:lla; CH2Cl2, dikloorimetaani.

3.5. Eläinkokeet

3.5.1. Ruumiinpaino

Käyneen sipuliuutteen vaikutusta ruumiinpainoon testattiin kuuden viikon ajan hiirillä, jotka saivat runsaasti rasvaa sisältävää ruokavaliota. Käymisteitse valmistetun sipuliuutteen ruokintaryhmässä havaittiin merkittävää ruumiinpainon laskua. Ravintokuidut, flavonoidit ja sipulin rikkikomponentit pienensivät tehokkaasti niiden ruumiinpainoa verrattuna pelkkää runsasrasvaista ruokavaliota saaneeseen ryhmään (tietoja ei ole esitetty). Tämä tulos viittaa siihen, että fermentoidun sipuliuutteen oraalisella annostelulla ei ole suoraa vaikutusta ruumiinpainoon, mikä on yhdenmukaista muiden tutkimusten kanssa .

3.5.2. Seerumin lipidipitoisuuksien mittaaminen

Serumi kerättiin joka viikko kuuden viikon ajan ja arvioitiin LDL-C-, HDL-C-, TG- ja TC-pitoisuuksien muutoksia. Kokeen lopussa seerumista testattiin HMG-CoA-reduktaasin ja CETP:n estovaikutus. Fermentoidun sipuliuutteen ruokintaryhmissä (pieni, keskisuuri ja suuri) LDL-C-taso laski merkittävästi viidennestä viikosta alkaen. Keskitasoisen ja korkean fermentoidun sipuliuutteen ruokintaryhmien ruumiinpainot laskivat jatkuvasti (taulukko 3). Lisäksi HDL-C-taso nousi ensimmäisestä viikosta kuudenteen viikkoon antamisen jälkeen (taulukko 4). LSP-11-supernatantin ruokintaryhmässä HDL-C- ja LDL-C-tasoissa tapahtui huomattavia muutoksia kolmannella ja viidennellä viikolla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että fermentoidulla sipuliuutteella saattaa olla synergisiä vaikutuksia Lactobacillus casei HD-010:n sekundaaristen metaboliittien toimintoihin.

Hoito annos (mg/kg/vrk) Matalan tiheyden lipoproteiini (LDL, mg/dl) 0 viikkoa 1 viikko 2 viikkoa 2 viikkoa 3 viikkoa 4 viikkoa 5 viikkoa 6 viikkoa Kontrolli 0 575.9±51.05 620.0±96.49 536.6±93.56 621.9±47.44 509.8±67.23 675.9±54.93 592.4±37.39 Alhainen 25 581.4±81.00 624.1±58.78 462.3±72.85# 624.4±26.62 484.6±52.17# 517.0±92.00 553.5±40.53 Mid 50 532.6±81.58 605.1±63.79 441.3±72.70# 597.1±55.23# 477.1±98.76# 486.7±59.18 547.4±31.61 High 100 517.0±39.48 595.9±64.42 336.4±62.60 591.0±89.04## 454.9±20.30## 484.2±69.66 500.3±77.92 L. casei KCTC 2180 100 612.6±60.79 677.9±114.79 593.6±47.41 723.1±28.63 625.6±55.93 685.7±72.79 624.0±26.55 Bentsafibraatti 10 597.3±90.47 581.8±40.11 513.4±67.09 652.3±83.81 649.9±69.99 652.4±76.33 590.0±24.63

Tiedot on esitetty keskiarvoina ± SD (10 eläintä ryhmää kohti; tehtiin kolme riippumatonta koetta). Statistinen merkitsevyys kontrolli- ja käsiteltyjen arvojen välillä määritettiin kaksinapaisella Studentin t-testillä p-arvolla; p-arvo < 0.05 ja p-arvo < 0.001 (verrattuna kontrolliryhmään); #p-arvo < 0.05 ja ##p-arvo < 0.001 (verrattuna L. casei KCTC 2180- ja bentsafibraatti-käsiteltyyn ryhmään).

Taulukko 3

Käymisteitse fermentoidun sipulin vaikutuksen avulla saatujen valmisteiden avulla saatujen tulosten perusteella. casei HD-010 seerumin matalan tiheyden lipoproteiinipitoisuuteen ApoE-puutteisilla hiirillä.

. Hoito Osa-annos (mg/kg/vrk) Korkeatiheyksinen lipoproteiini (HDL, mg/ dl) 0 viikkoa 1 viikko 2 viikkoa 2 viikkoa 3 viikkoa 4 viikkoa 5 viikkoa 6 viikkoa Kontrolli 0 45.5±7.41 47.1±1.05 44.3±8.95 50.8±3.20 36.0±4.23 31.4±4.43 44.8±2.27 Low 25 45.5±1.06 50.7±1.91 46.2±7.38 57.4±1.28 56.6±9.70 48.0±9.51 45.6±8.59 Mid 50 52.8±3.02 58.2±3.77 52.9±6.82## 65.3±0.92 58.6±4.10 51.8±3.41 56.2±7.73 High 100 56.6±8.96 64.2±6.00 55.4±6.81## 70.3±3.64 66.3±4.18 62.5±5.13 56.6±1.98 L. casei KCTC 2180 100 45.2±3.90 52.7±3.95 38.9±5.06 54.4±2.40 46.3±6.13 48.8±8.62 43.6±6.55 Bentsafibraatti 10 43.2±2.95 48.0±2.99 39.1±5.29 55.7±4.66 35.8±0.92 32.1±5.85 42.7±6.30

Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (10 eläintä ryhmää kohti; tehtiin kolme riippumatonta koetta). Statistinen merkitsevyys kontrolli- ja käsiteltyjen arvojen välillä määritettiin kaksinapainen Studentin t-testi ja se ilmoitetaan p-arvona; p-arvo < 0,05 ja p-arvo < 0,001 (verrattuna kontrolliryhmään); #p-arvo < 0,05 ja ##p-arvo < 0,001 (verrattuna L. casei KCTC 2180:een ja bentsafibraattihoidettuun ryhmään).

Taulukko 4

L. casei HD-010:lla fermentoidun sipulin vaikutus seerumin suuritiheyksisten lipoproteiinien pitoisuuksiin ApoE-puutteisilla hiirillä.

Serumin TG-arvot laskivat lievästi kaikissa ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään. Tällainen lasku ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä. Erityisesti runsaasti fermentoitua sipuliuutetta saaneessa ryhmässä TG-taso laski merkittävästi ensimmäisellä, toisella, kolmannella ja viidennellä viikolla (taulukko 5). TC-taso laski fermentoidulla sipuliuutteella ruokitussa ryhmässä viidennestä viikosta alkaen (taulukko 6). Positiivisessa kontrolliryhmässä, jota ruokittiin bentsafibraatilla ja Lactobacillus supernatantilla, ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa TC-tasossa kontrolliryhmään verrattuna.

Hoito annos (mg/kg/vrk) Triglyseridi (TG, mg/ dl) 0 viikkoa 1 viikko 2 viikkoa 3 viikkoa 4 viikkoa 5 viikkoa 6 viikkoa Kontrolli 0 406.6±35.68 561.2±54.01 334.4±60.37 652.3±65.16 302.3±48.56 412.2±75.99 284.8±54.11 Low 25 379.1±76.36 553.5±70.59 301.0±75.14 628.2±63.90 288.3±45.88 396.2±59.68 266.6±23.08 Mid 50 363.5±64.19 461.6±99.73 270.1±16.91 581.1±34.41 283.1±43.47 321.0±82.27 265.7±16.24 High 100 395.5±61.04 449.7±59.96 228.5±42.10 537.3±62.24 273.4±60.84 241.5±68.03 252.5±39.91 L. casei KCTC 2180 100 410.4±78.77 475.9±41.84 275.2±37.67 507.0±24.04 241.7±57.09 255.9±65.39 270.3±26.89 Bentsafibraatti 10 380.5±86.76 529.5±90.37 285.3±52.13 656.7±71.61 257.2±33.35 396.9±99.12 273.6±39.73

Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (10 eläintä ryhmää kohti; tehtiin kolme riippumatonta koetta). Statistinen merkitsevyys kontrolli- ja käsiteltyjen arvojen välillä määritettiin kaksinapaisen Studentin t-testin avullaja se ilmoitetaan p-arvona; p-arvo < 0.05 ja p-arvo < 0.001.

Taulukko 5

Käymisteitse fermentoidun sipulin vaikutus L. casei HD-010 seerumin triglyseridipitoisuuteen ApoE-puutteisilla hiirillä.

Hoito annos (mg/kg/vrk) Kokonaiskolesteroli (TC, mg/dl) 0 viikkoa 1 viikko 2 viikkoa 3 viikkoa 4 viikkoa 5 viikkoa 6 viikkoa Kontrolli 0 702.7±40.72 779.4±88.99 647.8±89.39 803.2±41.15 621.8±71.15 789.7±55.05 699.1±41.20 Low 25 702.7±88.48 785.5±63.45 568.7±82.61 807.5±19.50 598.8±46.83 644.3±79.84 644.8±39.13 Mid 50 658.1±73.41 755.7±51.34 548.3±67.92 778.6±57.04 592.3±91.15 602.7±62.89 641.1±60.00 High 100 652.7±28.06 750.1±60.31 437.4±61.70 768.7±83.53# 575.9±20.40# 595.0±73.14 619.4±78.28 L. casei KCTC 2180 100 739.9±48.37 825.8±113.75 687.6±52.21 879.0±32.08 720.2±66.89 785.8±79.01 715.2±33.01 Bentsafibraatti 10 716.6±90.81 735.7±26.94 609.5±66.18 839.3±92.52 737.1±73.97 763.9±87.42 687.4±19.36

Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD (10 eläintä ryhmää kohti; tehtiin kolme riippumatonta koetta). Statistinen merkitsevyys kontrolli- ja käsiteltyjen arvojen välillä määritettiin kaksinapainen Studentin t-testi ja se ilmoitetaan p-arvona; p-arvo < 0,05 ja p-arvo < 0,001 (verrattuna kontrolliryhmään); #p-arvo < 0,05 ja ##p-arvo < 0,001 (verrattuna L. casei KCTC 2180:een ja bentsafibraattihoidettuun ryhmään).

Taulukko 6

L. casei HD-010:lla fermentoidun sipulin vaikutus seerumin kokonaiskolesterolitasoon ApoE-puutteisilla hiirillä.

Käytimme ApoE-puutteisten hiirten mallia arvioidaksemme fermentoidun sipuliuutteen tehokkuutta lipidien kertymisen vähentämisessä, HMG-CoA-reduktaasin estossa ja CETP:n estossa. HMG-CoA-reduktaasi osallistuu kolesterolisynteesiin . Se väheni fermentoidun sipuliuutteen antamisen jälkeen. Vähennys ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkitsevä (kuva 5). CETP-proteiini toimii HDL:n ja LDL:n kuljettajana elimistöön, ja HMG-CoA-reduktaasi osallistuu kolesterolisynteesiin . Kuten kuvasta 5 käy ilmi, CETP-aktiivisuus ja HMG-CoA-reduktaasi vähenivät merkittävästi fermentoidun sipuliuutteen antamisen jälkeen (kuva 5). Nämä tiedot viittaavat siihen, että fermentoitu sipuliuute voi tehokkaasti estää suoliston rasvan adsorptiota estämällä CETP-aktiivisuutta.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 5

Efekti fermentoidun sipulin L. caseiHD-010 seerumin CETP- ja HMG- CoA-reduktaasiaktiivisuuteen ApoE-puutteisilla hiirillä kuudella viikolla. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD (10 eläintä ryhmää kohti; tehtiin kolme riippumatonta koetta). Tilastollinen merkitsevyys käsittelemättömien ja käsiteltyjen arvojen välillä määritettiin kaksinapainen Studentin t-testi ja ilmoitetaan p-arvona; p-arvo < 0.05 ja p-arvo < 0.001(verrattuna kontrolliryhmään); #p-arvo < 0.05 ja ##p-arvo < 0.001 (verrattuna L. casei KCTC 2180- ja bentsafibraattihoidettuun ryhmään).

Hyperlipidemiat ovat tärkeä kysymys terveydenhuollossa. Se liittyy moniin vakaviin sydän- ja verisuonisairauksiin. Monet kokeelliset ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että hyperlipidemia voi aiheuttaa verenpainetautia, diabetesta ja lihavuutta .

Monissa tutkimuksissa on raportoitu, että sipulin komponentit tai Lactobacillus voivat alentaa veren lipidipitoisuuksia. Sipuli on tunnettu perinteinen lääke. Sitä on tutkittu monissa epidemiologisissa tutkimuksissa . Aasian maissa dialyylisulfidia ja kversetiinia sisältäviä sipuli- ja valkosipulikasveja käytetään sydän- ja verisuonitautien ehkäisyyn. Sipuli sisältää noin 90 % vettä, 7 ~8 % sokeria (pääasiassa fruktoosia) ja pieniä määriä vitamiineja . S-metyyli-L-kysteiinisulfoksidi on yksi sipulin komponenteista. Se voi vähentää veren lipidipitoisuuksia. Kversetiinillä on samanlainen vaikutus lipidien tuotannon ja synteesin vähentämisessä eläinkokeessa . Lactobacillus voi myös vähentää veren kolesterolipitoisuutta. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että Lactobacillus voi estää sappihappojen imeytymistä ja kolesterolin kiinnittymistä soluseinään . Fermentoitua sipuliuutetta ei kuitenkaan ole vielä tutkittu hyvin. Vain harvat tutkimusryhmät ovat yrittäneet kehittää fermentoitua sipuliuutejuomatuotetta.

Tässä tutkimuksessa pyrimme tunnistamaan sopivan bakteerin sipulin fermentointia varten ja määrittämään sen vaikutuksen veren rasva-arvoihin. Tietomme viittaavat siihen, että fermentoidulla sipuliuutteella on vaikutusta rasva-aineenvaihduntaan suun kautta annettuna.

4. Johtopäätökset

Fermentoidun sipulin antihyperlipidemiavaikutuksen pääasiallinen vaikuttava aine oli kversetiini. Tuloksemme viittaavat siihen, että fermentoidulla sipulilla on ennaltaehkäisevä/terapeuttinen vaikutus hyperlipidemiaan. Sillä saattaa olla potentiaalia kehitettäväksi funktionaalisena elintarvikkeena.

Aineiston saatavuus

Aineisto on linkitetty http://www.nodagi.net:n verkkovarastoihin.

Interintäristiriidat

Artikkelin kirjoittajat ilmoittavat, että tämän artikkelin julkaisemiseen ei liity eturistiriitoja.

Tekijöiden panos

Woong-Suk Yang ja Jin-Chul Kim osallistuivat tähän työhön yhtä paljon.

Kiitokset

Tämä tutkimus sai osittain tukea Nodaji Co. Ltd., (Pohang, Korea) vuonna 2012.