Wood Frog Freezing Survival
Talvinen elinympäristö
Wedfrog (Rana sylvatica) asustaa metsissä Appalakeilta Merenkurkun provinsseihin ja länteen Alaskan pohjoisosiin, jopa napapiirille asti. Sen talvehtimispaikka on matala kolo metsänpohjassa reilusti pakkasvyöhykkeen sisällä, jonka päällä on lehtiä ja muuta orgaanista jätettä. Eteläisessä Ohiossa tekemämme tutkimukset viittaavat siihen, että viitasammakot altistuvat useille jäätymisjaksoille, jotka kestävät tyypillisesti useita päiviä ja altistavat sammakot lämpötiloille, jotka laskevat jopa -2° -4° C:een; pohjoisemmilla alueilla sammakot kokevat kuitenkin luultavasti paljon alhaisempia lämpötiloja ja pidempiä pakkasjaksoja.
Jäätymisen käynnistyminen
Monella eri mekanismilla taataan se, että viitasammakot jäädyttävät jäätymistään ilman, että ne jäähtyisivät laajasti. Ensinnäkin sammakkoeläinten ihon erittäin läpäisevän luonteen vuoksi sammakon ympärillä oleva jää voi välittömästi käynnistää kehon nesteiden jäätymisen. Lisäksi sammakon talvipesässä on runsaasti jään ydintymistä aiheuttavia aineita, kuten erilaisia mineraalihiukkasia, orgaanisia happoja ja tiettyjä mikrobeja, jotka voivat saada sammakon jäätymään. Laboratoriokokeet viittaavat siihen, että näiden aineiden nauttiminen edistää jään muodostumista jäätä sietävissä sammakoissa. Talvella kerättyjen viitasammakoiden suolistosta on viljelty useita bakteerikantoja, joilla on voimakasta jäätä muodostavaa aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että tällaiset bakteerit säilyvät koko talvihorroksen ajan (Lee ym. 1995). Jään tai talviympäristössä olevien jään ydintymistä aiheuttavien aineiden aiheuttama inokulaatio on luultavasti ensisijainen mekanismi, joka käynnistää jäätymisen sammakkoeläimissä; ei tarvita jään ydintymistä aiheuttavia proteiineja tai muita endogeenisiä jään ydintymistä aiheuttavia aineita, kuten joillakin selkärangattomilla eläimillä (Costanzo et al. 1999).
Pakkas-/sulatusstressit
Laaja-alainen jäätyminen jähmettää kudoksia, pysäyttää verenkierron ja riistää soluilta hapen. Koska jäätä muodostuu vain solunulkoisissa tiloissa, solujen sisällä oleva vesi vedetään osmoottisesti ulospäin, jossa se liittyy kasvavaan jääristikkoon. Tämän prosessin aikana solut voivat kutistua huomattavasti, mikä saattaa vahingoittaa kalvoja ja rakenteellisia tukijärjestelmiä. Makromolekyylit ja liuenneet aineet ahtautuvat pienenevään liuottimen tilavuuteen, millä voi olla haitallisia seurauksia. Jään muodostuminen kehon nesteissä aiheuttaa myös kasvavan jääristikon aiheuttaman mekaanisen vamman uhan, erityisesti tiiviissä ja hyvin rakenteellisissa kudoksissa ja elimissä. Jäärintamat voivat leikkautua ja erottaa kudoksia toisistaan ja häiritä solujen välisiä viestintäjärjestelmiä. Sulamisen jälkeen solunulkoisiin tiloihin muodostuu suuria laimean nesteen lammikoita. Solujen tilavuus, hydroosmoottinen tasapaino ja energiatilanne on palautettava.
Pakkasenkestävyyskyky
Laboratoriotutkimukset ovat osoittaneet, että metsäsammakot pystyvät selviytymään: (a) jopa 65-70 % ruumiinvedestään jäätyy, (b) ruumiin minimilämpötila on -6 °C ja (c) jäätyminen jatkuu yhtäjaksoisesti ≥ 4 wk ajan. Pakkasen sietokyky vaihtelee vuodenaikojen mukaan, sillä sammakot ovat kestävimpiä talvella. Kausittainen vaihtelu pakkasenkestävyydessä saattaa osittain heijastaa muutoksia tuotettavan kryosuojan määrässä. Selviytyminen riippuu hitaasta jäädyttämisestä, jotta kryosuojamekanismit voivat kehittyä täydellisemmin.
Pakkasesta toipuminen
Pakkasesta toipuminen on huomattavan nopeaa, ja fysiologiset ja käyttäytymiseen liittyvät perustoiminnot palautuvat yleensä muutamassa tunnissa sulatuksen jälkeen (linkki videoon matala kaistanleveys/korkea kaistanleveys; linkki NOVA:n scienceNOW-juttuun).Yhteistyössä Jack R. Layne, Jr. (Slippery Rockin yliopisto), työmme on osoittanut, että toipumisdynamiikalle on ominaista peruselintoimintojen peräkkäinen palautuminen asteittain monimutkaisempiin toimintoihin. Esimerkiksi sydän alkaa lyödä uudelleen jo ennen kuin jää on sulanut kokonaan, ja keuhkojen hengitys ja verenkierto palautuvat pian sen jälkeen. Takaraajojen lihasten supistumiskyky palautuu 1-2 tunnin kuluttua sulatuksesta, kun taas iskiashermoa hermottavan hermon toiminta palautuu noin 5 tunnin kuluessa. Takaraajojen vetäytymis- ja oikealle kääntymisrefleksit palautuvat useita tunteja myöhemmin, ja sammakoilla on tavallisesti normaali ruumiinasento ja koordinoidut motoriset toiminnot 14-24 tunnin kuluessa. Korkeamman asteen käyttäytyminen, kuten pariutumisvietti ja kosiskelukäyttäytyminen, palautuvat vasta useita päiviä myöhemmin (Costanzo ym. 1997).
Pakkasenkestävyysadaptaatiot
Yksi pakkasenkestävyyttä edistävä reaktio pakkasenkestävissä sammakoissa on jopa 60 %:n uudelleenjakautuminen kudoksissa normaalisti olevasta vedestä. Jäätyneen metsäsammakon paloittelu paljastaa, että suuri osa jäästä on sidottu imusuonistoon ja suolistoon, jossa se voi muodostua vahingoittamatta herkkiä kudoksia ja elimiä (Lee ym. 1992).
Jäätymisen sietokykyä edistää myös glukoosin nopea synteesi maksan glykogeenista ja tämän kryosuoja-aineen jakautuminen soluihin kaikkialla kehossa. Kertynyt glukoosi ilmeisesti parantaa solujen, kudosten ja elinten selviytymistä, koska kokeellisesti annosteltu lisäglukoosi sammakolle lisää sen pakkasenkestävyyttä (Costanzo ym. 1993). Yksi glukoosin tärkeimmistä tehtävistä on nostaa kehon nesteiden osmoottista painetta, mikä puolestaan vähentää jään muodostumista tietyssä lämpötilassa. Soluihin kulkeutuva glukoosi toimii osmolyyttinä, joka vähentää solujen kutistumista jäädytyksen aikana, ja se toimii myös käymiskelpoisena polttoaineena, jota voidaan käyttää hapettomassa tilassa. Metsäsammakko käyttää myös ureaa kryosuoja-aineena. Toisin kuin glukoosi, urea kertyy syksyn ja alkutalven aikana, ja se on jo solujen sisällä, kun jäätyminen alkaa. Joidenkin todisteiden mukaan urea on glukoosia tehokkaampi kryovammojen ehkäisyssä (Costanzo ja Lee 2005).
Aquaporiinit (AQPs) ja fasilitatiiviset urean kuljettajat (UTs) ovat kaksi kuljettajaproteiinia, joiden on todettu osallistuvan monenlaisiin fysiologisiin tehtäviin eri organismeissa. Viime aikoina näitä proteiineja on löydetty useista anuraneista, mutta niiden fysiologista merkitystä ei vielä täysin tunneta. Selvittääksemme AQP:iden ja UT:iden merkitystä talvehtivien sammakoiden osmolyyttitasapainossa tutkimme näiden proteiinien ilmentymistä sammakoissa, joilla on eriasteinen maastokäynti. Lisäksi mittaamme ekspression kausivaihteluita sekä ekspressiotasojen muutoksia vasteena talveen liittyviin stressitekijöihin metsäsammakolla.