Conception et préparation des plasmides shRNA

Pour aborder la question de la corrélation entre la séquence du shRNA et l’efficacité du knockdown, 27 vecteurs shRNA de 11 gènes différents ont été conçus et construits (tableau 1). Les séquences cibles ont été sélectionnées dans la région codante de chaque gène et ont été conçues pour être largement conformes aux études fondamentales sur les caractéristiques de la séquence pour l’efficacité des oligomères de siRNA. Par conséquent, les séquences sont peu nombreuses et ont un rapport G/C d’environ 50 %. Les shRNA ont été conçus pour cibler des sites dépourvus de polymorphismes de nucléotides simples et correspondent à tous les variants d’épissage amplifiés par nos ensembles d’amorces PCR en temps réel.

Puisque les siRNA peuvent avoir des effets hors cible, il est important pour les essais fonctionnels de faire un mutant spécifique avec un ou plusieurs mésappariements de base dans le site de reconnaissance de la cible comme contrôle . Pour économiser du temps et de l’argent, nous avons mis au point une méthode permettant de fabriquer simultanément des vecteurs shRNA de type sauvage et mutant (voir les détails dans Méthodes et Figure 1). Les résultats de l’élimination des gènes pour quatre paires de shRNA sauvages/mutants sont présentés dans la Figure 2. Ces résultats démontrent l’utilité de cette méthode pour obtenir un vecteur shRNA mutant ponctuel qui peut servir de contrôle de perte de fonction pour l’élimination de gènes par des shRNA de type sauvage. Bien que des protocoles détaillés aient été publiés pour la construction de vecteurs shRNA , il s’agit du premier protocole pour produire des vecteurs de type sauvage et mutant simultanément et devrait faciliter la mise en œuvre d’un système hautement contrôlé pour le shRNA.

Stratégie pour un séquençage précis à travers les structures en épingle à cheveux

Vérifier la séquence d’un shRNA en épingle à cheveux est essentiel puisque le mésappariement d’un seul nucléotide dans la séquence cible peut annuler le knockdown (Figure 2 et .) Un problème fréquemment rencontré dans la préparation des vecteurs shRNA est que beaucoup sont difficiles à séquencer en raison de la structure secondaire intrinsèque de l’épingle à cheveux. Une stratégie récemment proposée pour surmonter ce problème consiste à créer un site de restriction dans la région boucle/tige de l’épingle à cheveux pour séparer physiquement les répétitions inversées par digestion, puis à reconstituer la séquence en utilisant des amorces sens et antisens. Cependant, la capacité de réaliser le séquençage des constructions shRNA sans modifier la séquence tige/boucle serait un avantage évident. Pour aborder cette possibilité, nous avons évalué des réactions de séquençage modifiées pour améliorer la lecture de la structure secondaire de l’épingle à cheveux dans trois épingles à cheveux shRNA. Les modifications comprennent l’ajout d’agents connus pour détendre la structure de l’ADN, y compris le DMSO, la bétaïne, le PCRx Enhancer et la ThermoFidelase I ; et l’ajout de quantités croissantes de chimie dGTP BigDye terminator (dGTP) à la chimie standard BigDye v1.1 (BD) qui contient du dITP plutôt que du dGTP.

Les résultats du séquençage pour chacune des trois constructions d’ADN sont résumés dans le tableau 2. La lecture de la structure en épingle à cheveux a été mesurée comme le rapport entre la hauteur du pic environ 300 bases après la structure en épingle à cheveux et le signal environ 50 bases avant la structure en épingle à cheveux. Un rapport de 1 indique l’absence de perte de signal et 0 indique une perte complète de la lecture. En l’absence de tout additif à la chimie BD, l’épingle à cheveux a provoqué une réduction du rapport de hauteur de pic pour notre épingle à cheveux à structure moins serrée, pHSPG-shmutTLR4, à 0,4, et une perte totale de lecture pour les deux autres plasmides. Cela peut être visualisé comme un arrêt abrupt dans le profil du pic de séquence pour pHSPG-shTLR4 (Figure 3A).

Parmi les agents relaxants de l’ADN, le DMSO à 5%, la bétaïne 0,83 M et 1 × PCRx Enhancer ont chacun amélioré la lecture de la séquence de manière significative pour certaines constructions. Cependant, l’ajout de 0,83 M de bétaïne plus 1 × PCRx Enhancer à la chimie BD s’est avéré être la séquence la plus cohérente, avec des rapports de hauteur de pic de 0,5-0,9 (tableau 2 et figure 3B). L’ajout de produits chimiques BD:dGTP 10:1 seul a également amélioré quelque peu la lecture, avec des rapports de hauteur de pic de 0,5-0,6 (tableau 2 et figure 3C). Le rapport de hauteur de pic sous-optimal pour le BD:dGTP 10:1 peut être attribué à une étape visible dans le profil de pic de la séquence après la région de structure secondaire où le signal est réduit (figure 3C, flèche). L’augmentation du contenu de la chimie dGTP à 5:1 et 3:1 BD:dGTP ou l’utilisation de la chimie dGTP pure a augmenté le rapport de hauteur de pic et réduit quelque peu l’étape (rapport de 0,6 à 0,8). Cependant, l’incorporation mixte de dITP et de dGTP a entraîné un élargissement du pic plus important à mesure que la quantité de dGTP utilisée augmentait, et la chimie du dGTP seul a provoqué de graves compressions de la séquence (données non présentées). Les meilleurs résultats globaux ont été observés en combinant les chimies Betaine plus PCRx et BD:dGTP 10:1. Cette combinaison a permis de réduire le pas avec moins d’élargissement du pic et d’augmenter les rapports de hauteur de pic à 0,9-1,0 (tableau 2 et figure 3D). La ThermoFidelase I, une enzyme de déstabilisation de l’ADN fréquemment utilisée pour améliorer le séquençage de l’ADN génomique , n’a amélioré le séquençage d’aucune des trois épingles à cheveux dans la chimie BD directe (données non présentées), et a en fait réduit le rapport de hauteur de pic de manière significative dans les chimies BD:dGTP 10:1 pour les trois constructions shRNA, provoquant la réapparition d’un arrêt à la structure en épingle à cheveux (tableau 2 et figure 3E).

En résumé, la combinaison de chimies BD:GTP 10:1, de bétaïne 0,83 M et de 1 × PCRx Enhancer a fourni un séquençage optimal, et les chimies BD:dGTP mixtes, la bétaïne, le PCRx Enhancer et le DMSO ont chacun eu quelques effets positifs en soi. La ThermoFidelase I, cependant, devrait probablement être évitée pour les vecteurs shRNA avec une structure secondaire intrinsèque difficile.

Corrélation entre l’efficacité du knockdown par shRNA et les algorithmes publiés pour la conception de siRNA

Pour déterminer si l’efficacité du knockdown par les vecteurs shRNA est corrélée avec les règles publiées pour la conception d’oligonucléotides siRNA efficaces, les shRNA ont été évalués pour leur capacité à knockdown l’expression génique. Les shRNA ont été transduits de manière stable dans les lignées cellulaires humaines THP1 ou Jurkat, comme indiqué dans le tableau 3, dans les deux premières colonnes. Le knockdown moyen a été déterminé à partir de l’ARN collecté sur trois jours différents ou plus et est indiqué pour chaque shRNA (colonne 3). Le knockdown s’est avéré reproductible pour des lignées cellulaires qui ont été transduites et triées indépendamment, ce qui suggère que le knockdown est une fonction de la séquence cible du shRNA plutôt que des caractéristiques de la transduction virale. Plus d’un tiers des vecteurs shRNA construits n’ont pas réussi à supprimer la transcription (<10% dans la colonne 3), malgré des taux de croissance comparables et l’expression à long terme du marqueur GFP à des niveaux élevés dans ces lignées cellulaires. En outre, les grandes variations de l’efficacité de la suppression de plusieurs shRNA fabriqués contre plusieurs des mêmes gènes (c’est-à-dire CLR16.2, CLR19.3 et TLR4) plaident contre toute raison biologique simple pour les différences d’efficacité pour ces gènes. Un grand nombre des shRNA inefficaces ont des valeurs ΔΔG 5′ négatives et un score Reynolds élevé, chacun ayant été supposé en corrélation avec l’efficacité de l’élimination des siRNA (tableau 3, colonnes 4 et 5). À l’inverse, parmi les shRNA capables de conférer un knockdown génétique, plusieurs présentaient des valeurs 5’ΔΔG positives ou des scores de Reynolds faibles. Ces résultats indiquent que l’algorithme de notation 5’ΔΔG et Reynolds pour les siRNA peut ne pas fournir des critères corrélatifs positifs pour la conception de shRNA.

Pour déterminer si d’autres algorithmes publiés pour la conception d’oligonucléotides siRNA peuvent être appliqués aux vecteurs shRNA, chacun des sites cibles shRNA a été évalué par quatre algorithmes supplémentaires, et les scores ont été tracés par rapport au pourcentage de knockdown pour chaque shRNA (tableau 3, colonnes 6-9 et figure 4). Pour chaque algorithme, une ligne de meilleur ajustement a été tracée et la valeur R2 a été calculée pour indiquer si la variance de l’efficacité de l’élimination peut être expliquée par le score de l’algorithme. Les résultats confirment une faible association entre l’efficacité du shRNA et les considérations de 5′ ΔΔG (différentiel d’énergie libre) ou l’algorithme de Reynolds et al, et démontrent également une faible association avec l’algorithme de Hsieh et al, chacun montrant en fait une faible corrélation inverse avec les données. Les algorithmes d’Amarguizoui et al, d’Ui-Tei et al et de Takasaki et al sont en corrélation directe avec l’efficacité du shRNA. Cependant, aucun des scores des algorithmes n’explique un pourcentage significatif de la variance de l’efficacité de l’élimination. Parmi les algorithmes testés, le système de notation de Takasaki et al. présente l’association la plus élevée, avec une valeur R2 de 0,0251.

Parce que ces résultats suggèrent qu’une relation linéaire ne s’applique pas fortement au knockdown des shRNA pour aucun des six algorithmes, nous avons évalué chacun des algorithmes par une analyse de la courbe ROC pour déterminer si un algorithme est supérieur aux autres pour identifier les shRNA efficaces. La courbe ROC est un tracé de la sensibilité (la fraction de vrais positifs, TPF) par rapport à 1 moins la spécificité (la fraction de faux positifs, FPF) qui est générée en faisant varier le seuil de décision entre le score minimum et maximum de l’algorithme. La diagonale du graphique ROC représente la courbe ROC pour un algorithme qui n’est pas meilleur en matière de discrimination que la sélection aléatoire. Les algorithmes qui sont de mauvais discriminateurs ont des courbes ROC qui suivent la diagonale et dont l’aire sous la courbe ROC (AUC) n’est pas significativement différente de l’AUC de la diagonale (0,5). Les algorithmes qui sont de bons discriminateurs ont des courbes ROC avec une forte déviation convexe de la diagonale et des AUC qui s’approchent de 1 et qui sont significativement différentes de l’AUC de la diagonale.

L’algorithme de Hsieh et al. avait une courbe ROC concave (Fig. 5A) indiquant une sensibilité et une spécificité inacceptables pour discriminer les shRNA efficaces des shRNA inefficaces. Les courbes ROC de tous les autres algorithmes (figures 5B-F) se situaient près de la diagonale du tracé ROC et avaient des AUC qui n’étaient pas significativement différentes de l’AUC de la diagonale (figures 5B-F). Ainsi, aucun des algorithmes n’a montré une capacité statistiquement significative à discriminer les shRNA efficaces et inefficaces.

L’algorithme de Takasaki et al. (Fig. 5F) s’est révélé le plus prometteur en tant que discriminateur des shRNA efficaces et inefficaces. Cependant, cet algorithme a souffert d’une fraction de faux positifs relativement élevée pour les seuils de décision proches du score maximum, comme l’indique la déviation faible et erratique de la diagonale près de l’origine de la courbe ROC (Fig. 5F). Cela indique que l’algorithme a attribué un score élevé à un certain nombre de shRNA inefficaces. L’inspection des données a révélé que deux des trois shRNA inefficaces ayant obtenu un score élevé ciblaient des gènes dont l’expression avait été abaissée avec succès par d’autres shRNA (Tableau 3, astérisques). Il est donc peu probable que l’inefficacité des shRNA soit la conséquence d’une pression sélective contre la suppression stable de l’expression des gènes. Il est plus probable que l’algorithme de Takasaki et al. ne tienne pas compte d’une caractéristique essentielle des shRNA efficaces.

Application d’une modification de l’algorithme basée sur la stabilité des 6 bases centrales de chaque shRNA

L’inspection des propriétés physiques des shRNA inefficaces à haut score a révélé que la stabilité moyenne du duplex formé par les 6 bases centrales des shRNA (bases 6-11 du brin sens hybridées aux bases 9-14 du brin antisens) était supérieure à la stabilité moyenne des shRNA efficaces à haut score (ΔG = -13.1 ± 0,1 contre -11,1 ± 1 kcal/mol respectivement). Sur la base de cette observation, l’algorithme de Takasaki et al. a été modifié de sorte que les shRNA dont le ΔG du duplex central est égal ou inférieur à -12,9 kcal/mol se voient attribuer un score minimum (tableau 4). Cette modification a permis d’attribuer un score minimum à cinq shRNA, dont quatre étaient inefficaces, augmentant ainsi la spécificité de l’algorithme sans perte significative de sensibilité. Un score minimum attribué à un shRNA efficace (71 % de knockdown) indique que d’autres propriétés, outre la stabilité du duplex central, influencent l’efficacité. Néanmoins, l’ajout de cette modification a éliminé la faible déviation erratique de la courbe ROC par rapport à la diagonale pour les seuils de décision élevés et a augmenté l’AUC à 0,79 (Fig. 5I). Une modification similaire des algorithmes d’Amarzguioui et al. et d’Ui-Tei et al. a également augmenté les AUC de leurs courbes ROC (Fig. 5G et 5H). Avec cette modification, les AUC des courbes ROC des trois algorithmes modifiés étaient significativement différentes de l’AUC de la diagonale (Figs. 5G-I), indiquant une capacité de prédiction statistiquement significative. Les différences entre les AUC des courbes ROC pour les algorithmes modifiés n’étaient pas significatives, de sorte que sur le plan statistique, les trois algorithmes modifiés étaient d’une utilité égale. Les algorithmes 5′ ΔΔG, Reynolds et al, et Hsieh et al n’ont pas été améliorés à une capacité prédictive statistiquement significative en appliquant la modification ΔG duplex central (données non présentées).

Pour aborder la possibilité que l’amélioration obtenue par la modification des algorithmes d’Amarzguioui et al, d’Ui-Tei et al, et de Takasaki et al soit une conséquence de l’ajustement excessif de notre ensemble de shRNA, un ensemble indépendant de 38 shRNA regroupés à partir de publications précédentes ( ; Tableau 5) a été soumis à l’analyse. Alors qu’aucune des courbes ROC des trois algorithmes non modifiés n’avait une AUC significativement différente de celle de la diagonale (Amarzguioui et al., p = 0,174 ; Ui-Tei et al. p = 0,09 ; Takasaki et al., p = 0,26), tous les algorithmes modifiés ont donné des courbes ROC avec des AUC significativement différentes de l’AUC de la diagonale (p = 0,0001-0,009 ; figures 5J-L). D’un point de vue statistique, les trois algorithmes modifiés étaient d’utilité égale, car les AUC des courbes ROC des algorithmes modifiés étaient toutes significativement différentes de l’AUC de la diagonale, mais pas significativement différentes les unes des autres. Cette analyse d’un ensemble indépendant de shRNA suggère que la modification des algorithmes est d’une validité générale.

Parce que la minimisation du taux de faux positifs est la principale préoccupation dans la conception de shRNA, nous recommandons d’utiliser l’algorithme modifié de Ui-Tei et al. qui présente la fraction de faux positifs élevée la plus faible aux seuils de décision proches du score maximal, comme l’indique la forte déviation de la diagonale près de l’origine de la courbe ROC (figures 5H et 5K). L’utilisation d’un seuil de décision de 3 limite la sélection des shRNA à une région de la courbe ROC où la sensibilité était acceptable (0,28-,33), tandis que la spécificité était très bonne (1,0). En fixant ce seuil de décision, la fraction de faux positifs a été minimisée, tandis que 28 – 33% des shRNA efficaces ont été identifiés à partir de nos shRNA et de l’ensemble des shRNA publiés respectivement. Si la sensibilité devait être augmentée, nous recommandons d’utiliser un seuil de décision de 2. Ce seuil avait une sensibilité de 0,54 – 0,55 et une spécificité de 0,88 – 0,9. Si le seuil de décision est encore abaissé à 0, la sensibilité passe à 0,86 – 0,9, mais la spécificité tombe à 0,55 – 0,54. Nous recommandons d’utiliser le plus haut de ces seuils de décision possible.

Bien que statistiquement petite, cette étude a l’avantage à notre connaissance d’être le plus grand ensemble publié de shRNA à base de 19-mer à ce jour. En outre, contrairement à d’autres études sur les shRNA qui sont nécessairement biaisées vers les shRNA efficaces, notre étude inclut des shRNA fonctionnels et non fonctionnels. Nous avons montré que les algorithmes modifiés de Ui-Tei et al., Amarzguioui et al. et Takasaki et al. sont des outils prédictifs passables à bons qui permettent de distinguer les shRNA efficaces des shRNA inefficaces. Toutefois, les algorithmes modifiés présentent encore des lacunes importantes. Une évaluation directe des modifications apportées aux algorithmes à l’aide de shRNA conçus en fonction de chaque algorithme original et modifié viendrait étayer ces conclusions. Ces algorithmes sont destinés à réduire le nombre de shRNA faux positifs sélectionnés, et non à les éliminer complètement, et il faudrait donc un grand nombre de shRNA pour obtenir une différence statistiquement significative dans le taux de faux positifs. La disponibilité d’ensembles de données shRNA plus importants devrait favoriser le développement d’algorithmes présentant une sensibilité et une spécificité améliorées. En outre, plusieurs applications logicielles pour la conception d’oligonucléotides siRNA qui n’ont pas été prises en compte dans cette étude peuvent être utiles pour la conception de shRNA. Les critères de conception d’oligonucléotides siRNA fonctionnels restent controversés, comme en témoigne le grand nombre d’études encore en cours pour la conception de siRNA, et comme nous n’avons pas testé ces séquences en tant que siRNA, il est impossible d’établir si la modification de ces algorithmes s’applique également dans le contexte des oligonucléotides siRNA. Les shRNA présentent une couche supplémentaire de complexité par rapport aux oligonucléotides siRNA, car l’épingle à cheveux doit être traitée dans la cellule avant d’entrer dans le complexe RISC. De plus, on s’attend à ce que la pression sélective contre l’expression stable des shRNA qui sont délétères pour la croissance cellulaire apporte une contrainte supplémentaire à l’expression stable de certains shRNA. Malgré ces complexités, nos résultats commencent à donner un aperçu de la capacité d’appliquer des algorithmes de siRNA pour la conception de shRNA fonctionnels.